第七章 发酵生产染菌及其防治

所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养这一现象。
第一节 染菌对发酵的影响
一、染菌对不同发酵过程的影响
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
⑴ 种子培养期染菌 一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
⑵ 发酵前期染菌
⑶ 发酵中期染菌
⑷ 发酵后期染菌 由于在发酵后期，培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。
三、染菌程度对发酵的影响

第二节 发酵异常现象及原因分析
一、种子培养和发酵的异常现象
⒈ 种子培养异常
⑴ 菌体生长缓慢 ⑵ 菌丝结团 ⑶ 代谢不正常
⒉ 发酵异常
⑴ 菌体生长差 ⑵ pH值过高或过低 ⑶ 溶氧水平异常 ⑷ 泡沫过多 ⑸ 菌体浓度过高或过低
二、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。
⒈ 显微镜检查法(镜检法)
⒉ 肉汤培养法
通常用组成为0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化钠、0.8％蛋白胨、0.4％的酚红溶液(pH7.2，呈红色)的酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的该肉汤培养基中，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，每6 h观察一次微生物的生长情况，并取样进行镜检，该肉汤培养基由红色变为黄色或产生浑浊，即判断为染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体的检查。
⒊ 平板划线培养或斜面培养检查法
将待检样品在无菌平板或斜面上划线，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，一般24 h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。
无菌试验时，如果酚红肉汤连续三次发生变色反应(由红色变为黄色)或产生混浊，或平板（或斜面）培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时酚红肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。
三、发酵染菌原因分析
㈠ 染菌的杂菌种类分析
㈡ 发酵染菌的规模分析
① 大批量发酵罐染菌
② 部分发酵罐染菌 如果染菌发生在发酵前期，就可能是种子染菌、连消系统灭菌不彻底；如果是发酵后期染菌，则可能是中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏。
③ 个别发酵罐连续染菌(此时如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生连续染菌) 个别发酵罐连续染菌，大都是由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移的现象。
㈢ 不同污染时间分析
① 染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养基染菌。此时通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。
② 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。此时大部分染菌也是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气带菌等原因而引起。
③ 发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起染菌。

第三节 杂菌污染的途径和防治
一、种子带菌及其防治
生产上常用以下的一些措施予以防治。
① 严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。
② 在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保藏温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化。
③ 对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用。
④ 对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。
二、空气带菌及其防治
无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
三、操作失误导致染菌及其防治
灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”，使罐内温度与压力表指示的不对应，培养基的温度以及罐顶局部空间的温度达不到灭菌的要求，导致灭菌不彻底而染菌。因此，在灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀等，使蒸汽通过排空，达到彻底灭菌。
应严格控制灭菌的温度，过程最好采用自动控温。
在发酵过程中，如工人操作不当也会引起染菌，防止操作失误引起染菌，要加强对工人的技术培训和责任心教育，提高工人素质，强化措施和管理。
四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀(发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用)、电化学腐蚀(如氧溶解于水，使金属不断失去电子，加快腐蚀作用)、磨蚀(如金属与原料中的泥沙之间磨损)、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，而不能达到彻底灭菌的目的。生产上常把这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”。

图7-1 不锈钢衬里破裂造成“死角”

图7-2 发酵罐罐底脓疱状积垢

图7-3 罐底的加强板

图7-4 法兰的“死角”
a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角”

图7-5 灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法

图7-6 压力表安装不合理形成“死角”
1,6—发酵罐；2—缓冲管；3,4—压力表；5—旋塞
五、噬菌体污染及其防治
环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。
至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是以净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、改进提高空气的净化度、保证纯种培养、做到种子本身不带噬菌体、轮换使用不同类型的菌种、使用抗噬菌体的菌种、改进发酵设备装置、消灭“死角”、药物防治等措施。
生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施加以挽救：
⑴ 并罐法 ⑵ 轮换使用菌种或使用抗性菌株 ⑶ 放罐重消法 ⑷ 罐内灭噬菌体法
当噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种，或停产全面消毒，待空间和环境噬菌体密度下降后，再恢复生产。
六、杂菌污染的挽救与处理
⑴ 种子培养期染菌的处理
⑵ 发酵前期染菌的处理
⑶ 发酵中、后期染菌处理
⑷ 染菌后对设备的处理 染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热至120 ℃以上、30 min灭菌后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12 h以上等方法进行处理。