酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节 固定化酶
固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
固定化酶与游离酶相比，具有如下特点：① 极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；② 能够在较长时间内进行反应(分批反应和连续反应)，便于实现连续化和自动化；③ 大多数情况下，能够提高酶的稳定性；④ 酶反应过程能够进行严格控制；⑤ 酶的利用率提高，生产成本降低；⑥ 能够进行多酶反应；⑦ 可以增加产物的收率，提高产物的质量；⑧ 只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，较不适宜多酶反应，特别是需要辅助因子的反应等。
一、固定化酶制备的方法
制备固定化酶应根据不同的应用目的和不同的应用环境选择不同的方法，在选择时应遵循如下的原则：
① 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶蛋白的活性中心是酶的催化功能所必需的，酶蛋白的空间构象与酶活力密切相关。因此，在酶的固定化过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不发生变化，也就是酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
② 固定化酶应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。
③ 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。
④ 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，便于反复使用。
⑤ 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应。
⑥ 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的，实践中，可根据酶的性质、反应特征选择合适的方法。
㈠ 包埋法
包埋法可分为网格型和微囊型两种，将酶包埋于高分子凝胶细微网格中的称为网格型，将酶包埋于高分子半透膜中的称为微囊型。包埋法很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化。但是在包埋时发生的化学聚合反应，容易使酶活力降低，需要设计适宜的反应条件。载体通常采用惰性材料，载体上酶的活性是由结合的酶量(通常为载体材料质量的0.1％～10％)和酶的活力(0.1～500 U／mg)决定的。因此，可以通过调整结合到特定载体上的酶的数量，来调节固定化酶的活力。
⒈ 网格型
载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、胶原、明胶、海藻酸和角叉莱胶等天然高分子化合物。网格型包埋法也是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。
⒉ 微囊型
微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是酶对反应条件要求高的，制备成本也高。制备微囊型固定化酶通常有三种方法：界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法。
此外，还有脂质包埋法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。
㈡ 吸附法
⒈ 物理吸附法
酶被吸附于不溶性载体的一种固定化方法。此类载体很多，无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷酸灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白、纤维素衍生物等；大孔型合成树脂等。
物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。
⒉ 离子吸附法
这是酶通过离子键吸附于有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。用于此法的载体有阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶，Amberlite IRA-93，IRA-410，IRA-900；阳离子交换剂如羧甲基纤维素，Amberlite CG-50，IR-120，Dowex-50等。
离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是固定化的酶容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。离子吸附法也能用于微生物细胞的固定化，由于微生物在使用时会发生自溶，故用此法要得到稳定的固定化微生物较为困难。
㈢ 共价偶联法
这是酶与载体以共价键结合的固定化方法。共价偶联法所用载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：α-氨基或ε-氨基，α、β或γ位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活性基团。然后此活性基团与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
用共价偶联法制备的固定化酶，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，可以连续使用很长时间。但载体活化的操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至会影响对底物的专一性，或影响酶的空间构象而影响酶的催化活性，使酶的性质发生变化。
㈣ 交联法
借助于双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物细胞与微生物细胞之间发生交联反应，制成网状结构的固定化酶方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体碎片的固定化。
参与交联反应的酶蛋白的功能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨基的巯基和组氨酸的咪唑基等。作为交联剂有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N,N’-乙烯双马来亚胺等。其中最常用的交联剂是戊二醛，它有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，其反应式如下（E表示酶或微生物）：
交联法反应条件比较强烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。
㈤ 非共价结合法
对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是结晶法和分散法。
⒈ 结晶法
就是使酶结晶从而实现固定化的方法。对于晶体法来说，载体就是酶蛋白本身，它提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。
⒉ 分散法
将酶分散于水不溶的有机相中从而实现固定化的方法。可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。
不同的固定化方法各有其特点，吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但与载体结合差，在受到离子强度、pH值变化影响后，酶会从载体上游离下来。包埋法不适合于大分子底物。包埋法、共价偶联法、交联法三种方法虽结合力强，但不能回收再生。表9-1比较了各种固定化酶方法的优缺点，做出最佳的选择还要依据于特定的技术需要和资金考虑。
表9-1 固定化酶方法的优缺点比较
二、固定化酶的性质
酶固定后，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定后，由于扩散限制效应、空间位阻作用以及载体性质等因素必然对酶的性质产生影响。
㈠ 固定化酶的活力
为了获得最高的利润，增加固定化酶的稳定性是非常重要的。在操作条件下，通过分析酶活力随时间的损失来测定酶的稳定性。当酶活力下降的时候，可以根据最简单的动力学规律，预测残余的活力。不仅要跟踪酶活力随时间的变化来测定酶的稳定性，在实践中还要跟踪其产率变化，或者是将酶的消耗与产物的形成联系起来。
固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如，用羟甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30％，而对低分子底物活力保持80％。所以一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。
在同一测定条件下，固定化酶活力要低于等摩尔原酶的活力。原因可能是：① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；② 固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；③ 内扩散阻力使底物分子与活性中心接触受阻；④ 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。不过也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中，酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶活稳定性。
㈡ 固定化酶的最适pH值变化
酶催化能力对外部环境pH值特别敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH值与游离酶不同，酶活力-pH曲线常常发生偏移。图9-l是天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线。曲线偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响。一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH值向碱性偏移较天然酶偏高，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使扩散层H+浓度比周围的溶液高，即偏酸性，这样外部溶液中的pH值必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使酶表现出最大活力。反之，使用带正电荷的载体制备的固定化酶其最适pH值向酸性偏移。使用不带电荷的载体制备的固定化酶，pH值不发生偏移。
图9-l 天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线
1—固定化酶；2—游离酶
㈢ 固定化酶的最适温度
酶反应的最适温度是酶对热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶，其最适温度为80 ℃，比天然酶提高了30 ℃。酶固定化后，也会出现最适温度不变或下降的例子。
㈣ 固定化酶的稳定性
固定化酶的稳定性较天然酶高。Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现其中有30种酶固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8种稳定性降低。然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间的规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。
首先，固定化酶热稳定性提高(见图9-2)。作为生物催化剂，酶也和普通化学催化剂一样，温度越高，反应速度越快。但是，酶是由蛋白质组成的，一般对热不稳定，因此，实际上不能在高温条件下进行反应。固定化酶耐热性提高，使酶最适温度提高，酶催化反应在较高温度下进行，加快反应速度，提高酶作用效率。其次，在各种有机溶剂中的稳定性较高。固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。此外，固定化酶对不同pH值的稳定性、对蛋白酶作用的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都优于天然酶。据报道，有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。青霉素酰化酶在不同pH值的缓冲剂中，于37 ℃保温16 h测定酶活力，固定化酶在pH5.5～10.3活力稳定，天然酶则仅在pH7.0～9.0稳定，固定化酶的pH值稳定性明显优于天然酶。固定化酶稳定性提高的原因可能有以下几点：① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶伸展变形；② 酶活力的缓慢释放；③ 抑制酶的自降解，将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。
图9-2 固定化酶的稳定性变化
1—固定化酶；2—天然酶
三、影响固定化酶性能的因素
固定化酶的性能取决于酶和载体材料的性质，两者相互作用使固定化酶具备了化学、生物化学、机械及动力学方面的性质，固定化酶的特征参数如表8-2。由于酶本身活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化，也由于在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等原因，酶固定化后发生了性质变化。
表9-2 固定化酶的特征参数
第二节 辅酶和辅基的固定化
有些酶的催化作用需要存在另一种非蛋白质性质的化合物，这种化合物通常是小分子物质统称辅（助）因子，使酶表现其催化作用，缺少辅因子，酶就不能表现其活力。辅因子可以是简单的金属离子，即无机辅因子，例如Mg2+、Mn2+等，它起着维持酶蛋白还原状态或立体构型的作用，也可以是一种与酶蛋白联结在一起的有机物质，即有机辅因子，其作用是从某反应向另一反应传递物质。有机辅因子有两类：一是辅酶，它与酶蛋白结合得比较松散，并且往往能够通过透析法除去；一是辅基，它与酶蛋白通过共价键紧密结合，不易分开。辅基和辅酶与对应的酶蛋白有专一的亲和性，酶蛋白与有机辅因子相结合便形成全酶，由于有机辅因子的价格较昂贵，所以在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。
在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。因此，它们在继续使用之前，必须进行回收和再生，由于辅基与酶蛋白的结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。而对于辅酶来说，直接用超滤膜截留并不理想，因为辅酶分子一般较小，所用的超滤膜必须十分致密，才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，使反应产率降低。因此，为使辅酶能在酶反应系统中有效地参与反应，必须考虑辅酶的固定化。将辅酶固定在可溶性的或不可溶性的大分子载体上，这样就便于回收再生。
一、辅酶的固定化
辅酶的相对分子质量只有几百，将其包埋在半透膜中比较困难，若将辅酶与不溶性载体结合，则不能在多个酶之间起传递作用，因此，目前都是将辅酶结合于水溶性高分子载体上，使其高分子化来解决这一难题。辅酶高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位进行修饰，引入适当的官能团或间隔臂(手臂)，生成辅酶衍生物，然后再与水溶性高分子结合。
二、辅酶的再生
辅酶的再生是实际生产中必须考虑的问题，根据需要辅酶的酶反应系统的类型不同，辅酶的再生效率也不同。如将辅酶和酶蛋白共固定在同一个载体上，可得到一种不需外加辅酶而活性持久的固定化酶[图9-3(a)]。另一种较为有效的方法是将辅酶直接固定在某个酶蛋白分子上，原先可分离的辅酶便成了这一酶蛋白分子上被牢固结合着的辅基[图9-3(b)]。例如辅酶NAD+衍生物可直接共价结合醇脱氢酶，并仍能与此酶分子相互作用具有辅酶活性。这种酶蛋白-辅酶复合物如果被固定在某个电极上，便是一种酶电极。辅酶通过酶反应被还原，然后再经过电化学方法得到氧化。一种最理想的构型是一个酶的活性中心能与另一个酶的活性中心相互定向，而辅酶与其中一个酶蛋白分子相结合，它的间隔臂分子的长度又适于辅酶分子与两个酶的活性中心相互作用。这样辅酶便能在两个酶的活性中心之间进行游摆从而得到再生。
图9-3 辅酶和酶固定化的反应系统
三、辅基的固定化
首先，应选择合适的载体。理想的载体应具有以下的条件：没有特异性吸附，具有多孔性，有适合的官能团，化学稳定性好，具有适当的机械强度等。目前使用的载体主要有琼脂糖，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子载体等，最常用的载体是琼脂糖凝胶。其次，间隔臂的选择也非常重要。一般辅基分子和载体之间需要0.5～1.0 nm长的间隔臂。此外必须考虑辅基的性质，如疏水性、亲水性、离子性和体积大小等因素。
第三节 细胞的固定化
固定化细胞(immobilized cell)就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。这是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
固定化细胞的研究和应用始于20世纪70年代，固定化细胞技术后来居上，发展迅速，实际应用超过固定化酶。固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。固定化细胞也保持了胞内原有的多酶系统，这对于多步催化反应，如合成干扰素等，其优势更加明显，而且无需辅酶再生。尤其是固定化增殖细胞发酵更具有显著优越性：① 固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；② 发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续生产；③ 发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量等。由于固定化细胞既有效地利用了游离细胞的完整的酶系统和细胞膜的选择通透性，又进一步利用了酶的固定化技术，兼具二者的优点，制备又比较容易，所以在工业生产和科学研究中广泛应用。固定化细胞技术现在已经在工业、农业、医学、环境科学、能源开发等领域广泛应用。随着这一技术的进一步发展和完善，必将取得更加丰硕的成果。
目前，随着基因工程技术的发展，固定化细胞技术也应用于基因工程中。质粒的不稳定性对基因工程菌的培养和产物的生成有着极大的影响，将基因工程菌株固定化后培养可增加基因工程菌的稳定性、提高生物量和提高克隆基因产物的产量。非生长的基因工程菌的固定化，可提高其半衰期并能稳定操作较长时间。基因工程提供了改良的微生物，在利用这些微生物的时候，人们自然地考虑到使用具有很多优势的固定化技术，基因工程菌的固定化研究推动了固定化技术的发展。
一、固定化细胞分类、形态特征和生理状态
固定化细胞按其细胞类型分有固定化微生物、植物和动物细胞三大类；按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类(见表9-3)。
表9-3 固定化细胞的分类
固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状(与吸附物形状相同)等。目前大多数制备成球形颗粒，这是因为不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是柱反应器内易受压变形，流速不好，而采用球形颗粒就可以克服上述缺点；另外，球形颗粒由于其比表面积大，与底物接触面较大，所以生产效率相对较高。
被固定在载体内的细胞在形态学上一般没有明显的变化。通过光学显微镜、电子显微镜观测表明细胞的形态与自然细胞没有明显差别。但是，扫描电子显微镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包埋，都有类似情况。形成此种“凹池”的原因尚待进一步研究。
固定化死细胞(休止细胞)一般在固定化之前或之后，细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，比较适于单酶催化的反应。固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。固定化生长细胞又称固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。与固定化酶和固定化死细胞比较，由于细胞能够不断增殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反应时酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不解体不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶体系连续反应，所以说，固定化增殖细胞在生物发酵工业中最有发展前途。
二、固定化细胞的制备
固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，其制备方法和应用方法也基本相同。上述固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞的固定化，既适用于固定化死细胞，也适用于固定化活细胞。可把死细胞看做是一个充满酶的口袋，因此惟一的目的是要保持所要的酶的活力；固定化活细胞是传统发酵工艺的一种改进，具有增加发酵细胞密度、提高生产连续性的功效。
上面提到的固定化细胞的方法都涉及到细胞本身的变化或它的微环境的改变，从而使细胞的催化动力学性质发生改变，结果是降低了酶天然活力。为了长期、连续使用天然状态细胞，还可采用沉淀、透析等方法。例如，多次重复使用菌丝是最简单的细胞固定化形式之一，并已在工业上应用。影响沉淀生成的因素主要是培养基、pH值、溶氧浓度、振荡等。微生物菌体本身可认为是天然的固定化酶，选择适当的处理条件，如可以经过热处理使其他酶失活，而保存所需酶活力。
固定化完整细胞的方法虽有多种，但还没有一种理想的通用方法，每种方法都有其优缺点。对于特定的应用，必须找到成本低廉、操作简便的方法，保留酶高活力和维持操作稳定性，后两条是评价固定化生物催化剂的先决条件。
三、固定化细胞的性质
固定化细胞的发酵密度大、可增殖，缩短了发酵周期，可提高生产能力，发酵稳定性好，可反复使用，有利于产品的分离提取。特别是近几年发展的基因工程菌的固定化，有可能使大规模培养过程中重组菌的稳定性问题得到较好的解决。下面仅就固定化基因工程菌来阐述固定化细胞的性质。将固定化细胞和游离细胞相比较发现，固定化细胞具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、稳定性好等特性。
㈠ 目的产物的产量提高
固定化大肠杆菌BZ18 (pTG201)比游离细胞产生目的产物的量高20倍。用扫描电镜在凝胶表面50～150 μm距离内观察到有单层活细胞高密度生长，而在胶粒内部则无细胞生长。与之相似，大肠杆菌C600 (pBR322)在中空纤维膜反应器中也可高密度生长。在固定化体系中，细胞生长得更快，直至达到一个稳定状态，对相对游离体系而言，活细胞数目可达其11倍之多。
㈡ 克隆基因产物的表达
大肠杆菌在连续操作的中空纤维膜生物反应器中可得到较高的β-酰胺酶产率，并能维持3周以上。固定化体系与悬浮(游离)体系相比可选择性地获得高产量的β-酰胺酶，固定化反应器运行到第3天和第100天的产量分别是后者的100倍和1000倍。此外，在微载体上固定中国仓鼠细胞生产人干扰素可稳定生产一个月时间。固定化方法对提高克隆基因产物合成量的影响在培养若干代后的细胞上表现尤其显著。
㈢ 质粒的遗传稳定性
质粒(plasmid)的遗传稳定性是基因工程细胞最重要的因素，因为质粒是表达目的基因产物的载体。在基因工程细胞的培养过程中，存在两类细胞：转化细胞（P+细胞）和非转化细胞（P-细胞）。P+细胞是保留有DNA重组质粒，具备合成目的基因产物能力的细胞。P-细胞是由P+细胞退行而来的，不具备合成目的基因产物能力的细胞，表现为分离性不稳定（DNA重组质粒的丢失）或结构性不稳定（DNA重组质粒上编码目的产物的基因发生突变）。P+细胞因需合成更多的DNA、mRNA及蛋白质等而在生长上滞后于P-细胞，同时P+细胞的DNA重组质粒还须与染色体基因竞争合成目的产物所需的前体（如核苷酸、氨基酸等），而且P+细胞生长还受DNA重组质粒的数目、大小、目的产物的毒性等影响，所以在自然选择的状况下，P+细胞的生长繁殖是竞争不过P-细胞的。有关重组菌中质粒的不稳定性及其控制详见第十章。
在固定化体系中P+细胞可稳定遗传55代，传到第18代时，P+细胞量是游离细胞体系中的3倍。比较游离的和固定化的细胞在基础和LB培养基中的质粒遗传稳定性，发现在这两种培养基中固定化细胞质粒的遗传稳定性较高。质粒pTG201可稳定存在于3种固定化的大肠杆菌中。在通纯氧的固定化体系中质粒的稳定性和拷贝数可较好地维持，到第200代时仍接近初始的100％P+细胞量。在研究了固定化对pTG201质粒在大肠杆菌W3101中稳定性的影响后发现，酶的产量在解抑制温度42 ℃时有所提高，但质粒稳定性有所下降。如若采用两步连续培养则可克服质粒的低稳定性问题。
在固定化体系中质粒稳定性的提高不能用单一的因素来解释。虽然，P+、P-细胞之间有紧密的联系，但事实证明质粒在固定化细胞中的转移是不存在的。早期提出的隔室化理论并不能解释高稳定性，因为细胞长到第6代就足以将胶粒内部的空间充满。带有pTG201质粒的P+和P-细胞以87％和13％的比例共同固定化后繁殖了约80代，最后，P+和P-细胞在胶粒中比例不变，而与游离细胞体系大不相同。这样就证明了质粒稳定性的提高归功于P+和P-细胞无法在胶粒中竞争，以及固定化细胞在胶粒中繁殖缓慢的原因。同时微环境在稳定性方面也发挥了很重要的作用。对于固定化体系可以保护基因的稳定性至今尚无一个确定的解释。然而对于克隆基因分泌产物及其调控机制以及固定化细胞生理学的全面了解可以为提高重组细胞稳定性提供更多的信息。就形态和通透性而言，观察重组细胞内部细胞膜、细胞壁组成的变化是很重要的，它可以增加对提高重组菌中质粒稳定性的了解。
总之，与游离细胞体系相比，固定化技术可以明显提高基因工程细胞稳定性和目的基因表达产物的产量，并能保持宿主中质粒稳定性和拷贝数。
四、培养条件对质粒稳定性、菌体量及克隆基因产物的影响
对游离细胞体系、固定化（细胞）体系的影响因素有：接种量、各种介质、胶粒体积、基质浓度、营养物质、温度、pH值以及溶氧浓度等。
⒈ 接种量
重组细胞中质粒的稳定性程度受接种量的影响。早期的研究表明在胶粒表面50～150 μm附近固定化细胞呈单层生长，在胶粒内部没有观察到细胞生长，但减少接种量可以使胶粒表面和内部的重组细胞数均有较大程度的提高。这可能是由于胶粒中最初的低细胞量可以克服营养物质和氧气的传质限制，接种量在固定化细胞技术中的影响已有了系统的研究。
⒉ 固定化胶粒数量
Birbaum等研究认为胶粒在反应器中所占体积越大(即胶粒越多)，重组细胞生产目的基因产物的能力越强。在较低接种量的情况下，胰岛素原的产量随着胶粒数量的增加而增加，在胶粒数量过多时，从胶粒中游离出的细胞也会相应增加，但其内部的DNA重组质粒则可保持较高的稳定性。显而易见，若要提高反应器的体积产量，就必须采用高浓度的固定化胶粒。
⒊ 介质浓度
研究表明，凝胶浓度提高后，溶质扩散及溶氧摄取都随之降低而使转化反应受到影响。同样，在凝胶浓度一定的情况下，胶粒的大小(胶粒直径)影响目的产物的生产情况，胶粒直径越小则转化率越高。一般来讲，多采用2％介质（凝胶）浓度固定化重组细胞。
⒋ 营养物质
在游离细胞体系中质粒的稳定性会受到营养物质限制的影响。同样，在固定化体系中，葡萄糖、氮源、磷酸盐及镁盐中任一因素缺失都会影响到质粒稳定性。在上述诸因素中，磷酸盐和镁盐对质粒的稳定性影响最显著，这可能是由于导致胶粒中活细胞数目减少而造成的。
⒌ 温度及pH值
培养温度和pH值同样会影响克隆基因表达的产量。如在生产胰岛素原中，其生产菌表达的最佳温度介于25～30 ℃之间，pH值为7.0。Sayadi等研究了温度对大肠杆菌W3101中的pTG201质粒稳定性的影响发现，31 ℃时质粒均稳定存在于宿主中，温度升高到42 ℃时游离及固定化细胞中质粒稳定性均有所下降，这可能是因为介质中P+细胞与P-细胞相比缺乏竞争力的缘故。
为了将重组菌的生长及目的产物的生成两步分开，人们建立了基于温度变化的两步连续固定化培养法。第一步，温度控制在31 ℃，使大肠杆菌处于抑制状态而增加质粒的稳定性。从第一个反应器中释放的细胞不断地流入温度为42 ℃的第二个反应器中，该温度下可使重组细胞解除抑制而产生儿茶酚-2,3-二氧化酶。在研究了pH值对固定化的哺乳动物细胞的影响后发现，控制pH值在一定水平与不控制pH值相比，可多获得40％的目的产物。固定化体系的pH值范围多选择在7.0～7.6之间。
⒍ 溶氧浓度
Marin等利用向反应器中通入纯氧的方法提高了固定化大肠杆菌K12细胞中质粒的稳定性。这是因为重组细胞在通纯氧情况下比通空气的生长速率要慢，传代分化数目减少，从而产生P-细胞的概率降低，即P+细胞的概率增高，并进而提高重组细胞中质粒的稳定性。胶粒的形态测定显示，通纯氧10 h与通空气培养相比，胶粒内部可形成更大的菌落，且菌落占胶粒体积的百分比更大。在通纯氧的情况下，质粒的拷贝数及P+细胞数目可保持200代不变。 Huang等也发现类似的情况，他们认为通纯氧使质粒稳定性增加是由于重组菌生长速率降低及抑制了目的产物合成所致。
思考题
⒈ 简述固定化酶、固定化细胞制备方法与特点。
⒉ 简述固定化酶与游离酶的区别。 |
