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第六节 噬菌体
　　噬菌体（bacteriophage）是一类侵害细菌（包括放线菌）的病毒，又称细菌病毒（bacterialvirus）。具有其他病毒的共同特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等，为非细胞生物。其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成。在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体内都可存在。据噬菌体与寄主细胞的关系可分为烈性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两类。前者改变寄主的性质，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡；后者可因生长条件的不同，即可引起寄主细胞的裂解死亡，又可将其核酸整合到细菌的染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶原化。
　　噬菌体的危害主要存在于发酵工业，如乳制品、酶制剂、氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和菌肥生产等。由于它的个体比细菌小数百倍，可以附着于尘埃上随风飘移，因此能长久地扩散和传播到一定的范围，并能脱离寄主而存活。它在寄主细胞内能大量迅速繁殖子代噬菌体，如在十几分钟至一个小时左右，一个细胞感染一个噬菌体后可以释放出数十个至数百个子代噬菌体。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐，使工业生产遭到严重损失。
　　由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用于复制、转录和调节机理的研究。
λ噬菌体以原噬菌体方式存在于大肠杆菌K12株系中，利用紫外线诱导可以释放λ噬菌体，可感染已经丧失了λ噬菌体的大肠杆菌株系。λ噬菌体在大肠杆菌中可裂解生长或整合到寄主染色体中复制。λ-DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效地感染大肠杆菌；可以把25kb长的外源DNA插入λ-DNA，引入受体细胞；另外重组λ-DNA的筛选和保藏较易，故常作为分子克隆的载体。
一、噬菌体的形态和构造
　从形态学上可将噬菌体分为六群，其中1、2、3群有头部、尾部之分，为蝌蚪形：4、5两群没有尾部，是微球形，6群为纤维形噬菌体，是一条略呈弯曲的纤丝。目前我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌体，均属蝌蚪形（图2-125）。

图2-125　谷氨酸发酵侵染的噬菌体
　　侵染棒杆菌的一种噬菌体具有头部和尾部，头部呈明显的六边形，头部大小约为55nm。它是一种非收缩尾噬菌体，尾部呈杆形或弯曲，长约193nm×12nm。尾部末端可看到六个明显的钉状刺突，其中三个在一个平面上，另外三个在另一个平面上，两个平面互相平行，且垂直于尾。六个刺突在垂直投影面上形成六个角。
　　一种具有收缩性尾部的T噬菌体形态见图2-126。

图2-126 具有收缩性尾部的T噬菌体形态
　　T奇数噬菌体有多种，已报道的侵染北京棒杆菌的噬菌体有四种，这四种噬菌体是A2、A3、A133和A155。A133是收缩尾，A2、A3和A155是非收缩尾。尚未报道这四种噬菌体的尾端有刺突。噬菌体的形态特征及其寄主见表2-22。
表2-22　噬菌体的形态特征及其寄主
形态及特征* 大肠杆菌噬菌体举例 其他菌种噬菌体
2×DNA收缩性尾部 T2、T4、T6（DNA∶1.2×108，头部＝95nm×65nm，尾部＝20nm×110nm） 假单胞杆菌属12S，PB-1；芽孢杆菌属SP50；黏球菌属MX-1；沙门氏菌属66t
2×DNA非收缩性尾部 T1，T5，λ（DNA∶3.5×107，头部＝54nm，尾部＝10nm×140nm 假单胞杆菌属PB-2棒杆菌属B链霉菌属K
2×DNA非收缩性短尾 T4，T7（DNA：2.4×107，头部＝47nm，尾部＝10nm×15nm） 假单胞菌属12B土壤杆菌属PB-100沙门氏菌属P22

1×DNA无尾部，顶端衣
壳粒蛋白质较大

 ΦX174，SB（DNA：1.7×105，直径＝30nm） 沙门氏菌属ΦR

1×DNA无尾部，衣壳粒
蛋白质大小一致

 T2、MST、QB（RNA：9×105，直径＝24nm） 假单胞菌属7S
1×DNA无头部，
线状噬菌体		 fd，f1（DNA：1.3×106，直径＝6nm×800nm） 假单胞菌属
*形态大小不成比例。
　　噬菌体的化学成分绝大部分是核酸和蛋白质，它们占粒子重量的90％以上，其中核酸占40％～50％，多数噬菌体的核酸是单链或双链DNA，但近十多年来，发现不少的噬菌体所含的核酸就是RNA。噬菌体的外壳由蛋白质组成。
二、噬菌体的生长和繁殖
　　噬菌体的生长和繁殖过程包括五个步骤，即吸附（adsorption）、侵入（injection）、增殖（replication）、成熟（maturity）和释放（release）（图2-127）。
（一）吸附
　　吸附是噬菌体的吸附器官（尾丝、基板和刺突）与敏感寄主细胞的特殊位点的接触（图2-128）。尾丝首先触及寄主细胞表面，然后基板和刺突固定。一般说，噬菌体对寄主要求专一性很强，比如，产谷氨酸的北京棒杆菌噬菌体就严格地限于侵染北京棒杆菌。但也有些噬菌体也可以感染相近的种或属的菌株，如四环素生产菌的噬菌体。敏感的细胞并非整个细胞各处皆可吸附，须在特殊位点，而且大肠杆菌的受点还依噬菌体而异。T3、T4和T7噬菌体的特殊位点是脂多糖层；T2和T6是脂蛋白质，雄性专一噬菌体是F+细胞的纤毛。当然，噬菌体吸附的寄主细胞和特殊位点的专一性并非一致，程度有差异。

图2-127 噬菌体的生长和繁殖过程（烈性过程）

图2-128 大肠杆菌表面吸附的T4噬菌体
（二）侵入
　　吸附后，尾丝收缩，感染过程开始，对T类噬菌体就开始收缩尾鞘，结果不仅尾髓插入细胞壁，而且会像注射一样将DNA打入细胞内。蛋白质的外壳仍在壁外，而线状噬菌体fd则全部进入寄主细胞。从吸附到侵入时间很短，如T4仅需15s（图2-129）。

图2-129　噬菌体吸附在寄主细胞壁上并侵入
（三）增殖
　　噬菌体一侵入，增殖即开始，即核酸的复制和蛋白质的合成。先利用寄主的RNA聚合酶转录，噬菌体的mRNA被寄主的蛋白质合成体系翻译，形成一系列新的早期蛋白质。在T类噬菌体中，早期蛋白质包括一种新的DNA聚合酶，分解寄主的DNA的核酸酶，合成5-羟甲基胞嘧啶和它的ATP所必需的酶，以及转录形成后期蛋白质基因所需的蛋白质。然后开始噬菌体核酸的复制。在含有双股DNA的噬菌体中，复制过程与一般DNA复制相似。在含单股DNA的噬菌体如ΦX174中，一条互补的DNA被合成，形成了双股DNA，接着再以此作模板合成RNA和子代DNA。第二步是后期蛋白质开始出现。在T类噬菌体中，合成的后期蛋白质是噬菌体头和尾成分的亚单位，还有噬菌体的溶菌酶。这种酶能分解寄主细胞壁的肽聚糖。
（四）成熟
　　当所有噬菌体结构成分都已合成时，成熟过程（即“装配”）便开始。在T4中，装配一个成熟噬菌体约需30种不同的蛋白质，而且至少具有47种基因功能。其过程先是DNA的凝聚，头的亚单位被组装成头部，尾和尾丝也各自组成。然后按从头至尾的顺序自我装配，最后将尾丝装上，形成一个完整的噬菌体（图2-130）。
（五）释放
　　噬菌体繁殖的最后阶段是裂解释放出子代噬菌体。裂解T类噬菌体感染的细胞要涉及两个或更多基因的作用，至少一个作用于细胞膜，另一个具有溶菌酶的作用将分解壁的肽聚糖，线状噬菌体则不裂解寄主细胞，可能是通过挤压而冲出细胞壁。
　　每种噬菌体侵入敏感细胞，每个细胞最后能装配完成和释放出的噬菌体数称为裂解量，它是相对固定的。如T4为100，ΦX174为1000，f2为10000，T2为200；谷氨酸产生菌的噬菌体为50～150。
　　图2-131为噬菌体一步生长曲线，这是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。实验时必须用噬菌体去感染高浓度的寄主细胞，以保证每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个。由于众多寄主细胞的裂解不可能同步，所以释放期较长。

图2-130　噬菌体的组装

图2-131　噬菌体一步生长曲线
（六）噬菌体效价的测定
　　效价（titre）在这里的含义是表示每毫升试样中所含具有感染性噬菌体的数量，也称噬菌斑形成量（plaque-forming unit）。
　　测定效价的方法常用双层平皿法。在已倒2％琼脂下层的平皿上，将1％琼脂上层培养基与敏感寄主细胞和噬菌体试样稀释液混匀凝固后，37℃培养10多个小时，平皿表面会形成具有一定形状、大小和透明度的噬菌斑。由于一个噬菌体先侵染一个细胞，然后以此为起点再反复侵染周围大量细胞，结果形成可观察到的一个噬菌斑。据知一个直径2mm的噬菌斑含有107～109个噬菌体。
三、噬菌体的生活史
　　噬菌体有两类，大多数噬菌体是烈性的，如T4、T7、ΦX174等，它们在生长循环结束时就杀死细胞，其过程就像整个生长繁殖过程。不过，在自然界还存在另一种噬菌体，称为温和性噬菌体。
　　温和性噬菌体感染一个敏感细菌菌株时，根据各种遗传和生理条件，有两种可能的行为，即一些细胞被噬菌体增殖所裂解，而另一些则被溶原化。
　　温和性噬菌体侵入寄主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的DNA上，并随寄主细胞的复制而进行同步复制，不引起寄主细胞裂解的现象称“溶原化”。能引起溶原化的噬菌体即称温和性噬菌体，已整合到寄主DNA上的噬菌体就称“原噬菌体”，这时的寄主就称“溶原菌”（lysogenic bacteria）。以“原噬菌体”的方式嵌存于寄主的DNA中，可随寄主繁殖，延续传代，“和平共处”，一般不引起细胞裂解。产生溶原化的菌株的命名方法是，在菌株名称后加上括号，括号内是它们所携带的原噬菌体的名称。如E．coli（λ），λ即为大肠杆菌菌株携带的原噬菌体。
　　温和性噬菌体的生活史如图2-132所示。

图2-132　温和性噬菌体的生活史
　　像菌株的其他遗传特性一样，溶原性通常也是菌株的一种非常稳定的特性。因此在大多数溶原细菌细胞群体中，只有极少数溶原菌会丢失它们的噬菌体，失去的原因尚不很清楚。溶原性细胞经诱导也可变成“烈性”状态，即也可复制和溶解寄主细胞并释放出正常的有感染力的噬菌体。另外，溶原菌对于同一种噬菌体或是与之密切相关的噬菌体表现出免疫性，即它不能再被同一种噬菌体所裂解或溶原化。但免疫性不同于细菌对噬菌体的抗性，抗性是由于细胞表面受体部位结构的改变而使得噬菌体不能吸附。
　　溶原性细菌易识别，只要把溶原细菌在固体培养基上划线，当划过一个对噬菌体敏感的菌株时，沿着溶原性细菌的边界处可以看到一个窄的裂解区。当溶原性细菌被强烈因素处理时，也易于转变为烈性。此外，许多菌株可被几个不同的噬菌体溶原化。
四、噬菌体的分离检查
　　噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。为此，必须采用特殊的方法对噬菌体进行分离检查。
（一）分离方法
1．分离样品的制备
1）分离源为液体时，可进行一次离心分离，即在10000r／min的转速下分离10min，除去杂菌，用上清液作为分离样品。
2）对于土壤等固体材料，可先取1～2g固体悬浮于5～10mL培养基内，然后取离心上清液为样品。
3）以溶原菌的培养液作为样品时，考虑到诱导噬菌体的产生，可用紫外线或丝裂霉素C处理后，再进行培养。
4）要从设备或容器的表面分离噬菌体，可先用灭菌棉签用力地擦拭容器的表面，然后将棉签放入2～3ml培养基充分洗脱。以此液体作为分离样品。
5）由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，使空气进入培养基内，此经捕集的培养基即可作为分离样品，而在噬菌体密度高的位点，只要将长了寄主菌的平皿打开，在空气中暴露30～60min即可。
　　经制备后的样品中噬菌体含量太少时，可将样品放在寄主菌液内培养适当时间，使噬菌体繁殖。为避免杂菌增殖，可加入过滤的样品或采用抗链霉素的寄主菌，在加链霉素的情况下进行培养。有两种以上噬菌体存在时，培养时间短，以免增殖速度慢的噬菌体为增殖快的噬菌体所压倒。当然，也可用膜滤器浓缩。
2．寄主细胞的培养
　　在分离噬菌体时，可采用能使噬菌体增殖到一般程度的培养基。若菌的生长过于旺盛，有时反而不会形成噬菌斑。因为有的噬菌体的吸附和增殖要求有特殊的物质，所以最好用含蛋白胨、酵母膏等的半合成培养基，并在其中补加10－３mol／L的Ca2+和10－２mol／L的Mg2+。当难以做出选择时，可先用补加Ca2+的无糖肉汁培养基试试。
3．分离方法
　　预先分别配制含2％和1％琼脂的下层培养基和上层培养基，在固化下层琼脂培养基的平皿中将融化的上层软琼脂培养基与寄主细胞混合，并使其布满平皿，然后用接种环、毛细管或微量吸管取样品在培养皿上点12～25个点，待液体被培养基吸收后培养过夜，检查点样部位有无噬菌斑出现。噬菌体少时，噬菌斑集中；有时噬菌体量太多，看不到噬菌斑，尤其是那些取自溶原菌的样品。此时可同时检查原液和稀释液，就不至于造成这种情况。也可不用改变稀释度的方法进行检查，而是以接种环取样品原液点在涂有菌的平皿的一角上，然后进行连续弯曲的划线。样品数量特别多时，可将几个样品混合后进行检查，然后舍弃阴性试样。
　　由溶原菌分离噬菌体可用大型接种环取敏感菌的菌悬液在平皿上划两条线，然后将待试的噬菌体的悬浮液与一条直线交叉划八字横线，经适当剂量的紫外线照射后进行培养，检查交叉处有无噬菌斑出现。
（二）噬菌体的纯化和噬菌斑的形状
　　用接种针挑取单个的噬菌斑，将黏着的噬菌体悬浮在1mL培养基内，经适当稀释后，再使之重新形成噬菌斑（图2-133）。再反复进行此操作，直至证实其为纯的噬菌体为止。
噬菌斑的形状因噬菌体种类而异，但可归纳为如图2-134所示的几种基本的形状。
噬菌斑的大小不等。有的小如针尖，一般称为针孔状噬菌体，有的直径达10～15mm，即使是同一种噬菌体，其噬菌斑大小也会因培养基组成和pH值、软琼脂培养基数量和琼脂浓度、菌龄和菌数、平板培养温度和时间等条件的不同而异。即使在同一条件下，其大小也往往不同。
　　总之，在分离噬菌体时，必须注意观察噬菌斑的形状。如按照上述方法，使形状、大小不同的噬菌斑再产生噬菌斑，便可大体了解样品中存在的噬菌体种类。

图2-133　噬菌斑

图2-134　噬菌斑的形状
白色为溶菌而透明；黑色为细菌生长；无论何种形态，均有边缘清晰与否之分

　　
　　要想知道所分离的是什么噬菌体，可根据其寄主范围，对噬菌体抗性菌的交叉抗性、抗噬菌体血清的交叉中和反应、增殖特性、粒子形态及核酸类型等进行进一步的研究，以判断它们与已保藏的噬菌体的异同。
（三）噬菌体保存液的制备和保藏
1．制备
　　为了制备高效价噬菌体液，可将纯化过的噬菌体加到液体培养基中增殖了的菌液内，培养到发生溶菌为止（有时经长时间培养后会重新变为混浊）。当不能见到溶菌时，可将培养液的离心上清液加到新鲜的培养液中反复进行培养。这样即使不能见到溶菌，噬菌体的效价也很高。当不能得到高效价噬菌体时，可改变培养基、菌液浓度、菌和噬菌体的比例，以及加入噬菌体的时间等，再进行试验。
　　此外，还可在噬菌斑发生重叠的几乎整面都发生了溶菌的平板上加入2～3mL培养基，用玻璃棒弄碎琼脂层，于37℃下放置20～90min（也可不弄碎琼脂层，培养3～5h），使噬菌体游离。在用液体培养法不能得到高效价噬菌体时，可以采用这种方法。
2．保藏
　　将噬菌体保藏液离心分离后的上清液或过滤液（尽可能纯化了的噬菌体液）在4℃密藏，多数可保存颇长时间。若要长期保存，则可加入甘油、血清、脱脂牛奶等分散剂，在冷冻状态保藏（使用超低温冷库等），或经冷冻干燥后保藏。简便的方法是用灭菌滤纸片或琼脂片浸透噬菌体进行保藏。温和噬菌体不能制成保藏液，多以溶原菌形式保藏。
五、理化因素对噬菌体的影响
　　噬菌体受理化因素作用后失去感染性，称为灭活（inactivation）。灭活的噬菌体仍保留某些活性。
（一）物理因素
1．温度
　　大多数噬菌体耐冷不耐热，在0℃以下能良好生存，特别是在干冰温度（-70℃）和液氮（-196℃）温度下更可长期保持其感染性。相反，大多数噬菌体于55～60℃，几分钟至十几分钟即被灭活，100℃时在几秒钟内即可灭活噬菌体。即使是体温（37～38.5℃）也可能使某些噬菌体灭活。冻融，特别是反复冻融可使许多噬菌体灭活。因此，噬菌体标本的保存应尽快低温冷冻并且避免不必要的冻融。有蛋白质或Ca2+、Mg2+存在，常可提高某些噬菌体对热的抵抗力。
2．pH值
　　一般来说，大多数噬菌体在pH6～8的范围内比较稳定，而在pH5.0以下或者pH9.0以上容易灭活。但各种噬菌体对pH值的耐受能力有很大不同。噬菌体对pH的稳定性是常被用的噬菌体鉴定指标之一。
3．辐射
　　电离辐射中的γ射线和X射线以及非电离辐射中的紫外线都能使噬菌体灭活。有些噬菌体，经紫外线灭活后，若再用可见光照射，因激活酶的原因，可使灭活的噬菌体复活，故不宜用紫外线来制备灭活病毒疫苗。
（二）化学因素
1）脂溶剂。噬菌体对脂溶剂敏感。乙醚、氯仿、丙酮、阴离子去垢剂等均可使噬菌体灭活。
2）氧化剂、卤素、醇类病毒对各种氧化剂、卤素、醇类物质敏感。H2O2、漂白粉、高锰酸钾、甲醛、过氧乙酸、次氯酸盐、乙醇和甲醇等均可灭活噬菌体。
 
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