| 第四节 酵母菌 |
酵母菌是一类单细胞微生物，但不同于细菌，属真核微生物。
数千年前，人们虽然不知道酵母菌是什么样子，但却利用酵母菌的发酵能力来酿酒，后来又用来烤制面包。在现代工业中，酵母除了用来酿制酒类、乙醇外，还可用于生产甘油、食用酵母、饲料酵母，石油脱蜡，发酵生产有机酸和酶制剂等。由于酵母细胞中富含核糖核酸、细胞色素c、辅酶A等，所以它也是制药工业中的重要原料。
目前已知的酵母菌有490余种，比其他微生物的种类要少，酵母菌喜生长在含糖的环境中，成熟果子的皮上通常含有酵母菌，相对地讲果园的土壤中含酵母菌也多些。
一、酵母菌的形态和大小
（一）细胞形态
酵母菌是单细胞微生物，它的细胞形态因种而异（图2-63），除常见的球形、卵形和圆筒形外，某些酵母还具有高度特异性细胞形状，如柠檬形或尖形。 |
图2-63 酵母菌细胞形态 |
柠檬形或尖形酵母通常是在果子和浆汁的天然发酵或腐败的早期阶段发现的。它们是有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）和它的不完全型克勒克酵母（Kloeckere）。一种尖顶形细胞在其另一端使伸长出的细胞变圆，有的另一端会突出，这是德克酵母属（Dekkera），即不完全型的酒香酵母属（Imperfectbrellawomyces）的酵母特征，这种酵母在西欧曾用于啤酒酿造，但该属的某些种亦是瓶装葡萄酒和软饮料的腐败微生物。一种具有瓶状细胞的酵母，属于瓶形酵母属（Pityrosporum），它是在细胞的一极以重复芽裂方式繁殖的，因此形成瓶状。三角形酵母属（Trigonopsis）的三角形细胞是很少见的，它们可以从啤酒或葡萄汁中分离出来，在发酵腐烂的仙人球汁中出现的酵母是一种高度弯曲的隐球酵母。
细胞的特殊形状虽是菌属的特征，但并不意味着个体发育的每个时期都具有这种形态。例如，柠檬形的尖端酵母，通常以球形和卵形的芽与母细胞分离，然后开始芽本身的发育。因为出芽是两极性的，一个具有幼芽的卵形细胞在它们的一极又伸长发芽，就会变成柠檬形。由于重复的二极出芽，较老的细胞就会有形状的变化（图2-64）。 |
图2-64 柠檬形酵母不同出芽阶段的细胞形态 |
（二）细胞的大小
一般酵母细胞的长度为2～3μm，而某些细胞可达20～50μm。
酵母细胞的宽度也有变化。一般在1～10μm。在年幼培养物中，一些种的细胞的实际大小和形态极不均一，而另一些种却是十分一致的。这种不一致程度可以用于鉴别菌种，在一些情况下，也可用于区别同一种的变种。
观察细胞大小和形态的培养基常用麦芽汁，但最好用合成培养基，因后者有较好的重复性。对不同的酵母菌的描述，应以在最佳的标准条件下得到的结果为依据。
二、酵母菌的细胞构造
酵母细胞构造不能一概而论，因为不同酵母菌种显示出一定差异。有关酵母细胞构造的描述一般都根据酿酒酵母和面包酵母的研究资料获得。近来的研究表明，对于不同的属，能形成一些特殊的结构，而且培养条件也会引起明显的细胞学变化。例如，细胞壁的厚度、细胞形状，脂肪粒、液泡和其他内含物的存在、线粒体的发育和膜多糖形成的程度等，都能随培养条件的改变而发生变化。
酵母细胞学的资料可以通过下列方法得到：用光学显微镜直接观察；用染料染色，或用增光剂去测定特殊成分或表面区域的位置；用透射电子显微镜观察酵母细胞的超薄切片，或用扫描电子显微镜观察细胞和子囊孢子的表面。
酵母细胞的典型构造如图2-65所示。它一般包括细胞壁（一些种中有黏性荚膜）、细胞膜、细胞核、一个或多个液泡、线粒体、核糖体、内质网、微体、微丝、内含物等，此外还有出芽痕和诞生痕。
（一）细胞壁
用普通光学显微镜可看到细胞壁（cell wall）的外廓。它虽然有一定柔性，但其坚韧性使酵母保持特殊的形状。细胞壁的厚度约为0.1～0.3μm，重量为细胞干重的18％～25％，能有效地保护细胞正常地生存，当细胞衰老后，细胞壁重量会增加一倍，但即使用放大倍数最大的光学显微镜也不可能清楚地观察到细胞壁的特征，除了偶尔能看到不规则的小圆点外，只能观察到很光滑的细胞轮廓。 |
图2-65 酵母菌的细胞结构模式图和电镜切片图 |
酵母细胞壁的很多理化性状是通过电子显微镜观察和用化学制备与分离壁的技术而获得的。其化学成分大多是根据化学分析与酶解细胞壁的综合结果而确定的。
酵母细胞壁由三层组成，即碱非溶性的β-葡聚糖内层、碱可溶性的β-葡聚糖中间层和糖蛋白的外层，该层的糖类由磷酸化的甘露聚糖组成。细胞壁的有关脂类物质的确切位置尚不清楚。
当细胞壁用热碱萃取时，碱非溶性残余物（约30％～35％）会形成保持酵母细胞形状和坚固性的葡聚糖。近年来的研究证明，这种葡聚糖是两种多糖的混合物。其中较多的一种（占85％）主要为β-（1→3）键的葡聚糖，而作为分枝点是3％的β-（1→6）键；较少的一种多糖（占15％）由具有β-（1→3）中间残基键的高度分枝化的β-（1→6）葡聚糖构成。通过电子显微镜观察发现，碱非溶性葡聚糖在细胞壁中是以一种紧固的微网状而存在的。
细胞壁的碱性萃取物由一种碱溶性的葡聚糖和甘露聚糖蛋白质复合物的混合物组成，它约占细胞壁成分的20％～22％，处于中间层。它与碱不溶葡聚糖之间的主要差别是，在长长的β-（1→3）键连接葡萄糖键中存在若干β-（1→6）键连接的葡萄糖残基。这些异常键干扰了附近分子的氢键和微纤维的组成，使这种非晶形葡聚糖在碱液中变得可溶解了。
作为细胞壁外壳的甘露聚糖蛋白质复合物，其蛋白质含量约为5％～10％。
细胞壁的物质组成为：葡聚糖35％～45％，甘露聚糖40％～45％，蛋白质5％～10％，几丁质1％～2％，脂类3％～8％，无机物（如磷酸盐筹）1％～3％。磷酸盐主要存在于甘露聚糖蛋白质复合物中。
几丁质是一种线状的N-乙酰氨基葡萄糖的多聚体，其单体间以β-（1→4）键相结合。几丁质与纤维素分子结构见图2-66。
早期的研究中，酵母细胞壁的几丁质含量是以测定它们的N-乙酰氨基葡萄糖的含量来推算的，当时尚不知氨基糖也存在于甘露聚糖组分中，而只知道几丁质的含量很少。现在的研究表明，几丁质仅出现于出芽痕中，当一个芽完全发育时，首先就是初生的含有几丁质的隔膜与母细胞分开，然后，初生的隔膜被葡聚糖和甘露聚糖所覆盖。一个不出芽的子细胞或者没有几丁质或含量极微，而具有很多出芽痕的细胞就可能含有很多几丁质。在丝状酵母，如内孢霉和拿逊酵母属（Nadsonia）、红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属（Cryptococcus）和掷孢酵母属（Sporobolomyces）中，几丁质含量是很高的，大概是细胞壁的主导成分；相反，在裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）中几乎没有几丁质。 |
图2-66 几丁质与纤维素分子结构 |
（二）荚膜物质
在讨论酵母细胞壁时，必须注意荚膜物质（capsular materials）在酵母菌中的存在（图2-67），酵母的细胞外物质的基本成分是：磷酸甘露聚糖、β-键合的甘露聚糖、杂合多糖（含有多于一种类型的糖单位）和属于鞘类脂成分的疏水物质。
某些汉逊酵母和那些与毕赤氏酵母属（Pichia）和管囊酵母属（Pachysolen）密切有关的属产生胞外磷酸甘露聚糖。这些黏性的多聚体是水溶性的并在细胞表面形成黏性层。属于红酵母属的红酵母是产荚膜菌种。黏的荚膜物质由一些线状或稍微分枝的具有互变的β-（1→3）和β-（1→4）键的甘露聚糖所组成。
多数荚膜多糖黏性物黏附于细胞上，但其中较大的部分可能释放入生长的培养基中，特别是在搅拌培养时。有的荚膜物质含有四乙酰植物鞘氨醇和三乙酰二氨鞘氨醇，它们是复杂的疏水化合物，可以使部分酵母在液体培养中具有形成小球的趋向。它们的菌落还有表面粗糙的特征。 |
图2-67 酵母荚膜物质 |
(三)细胞膜
细胞膜（cytoplasmic membrane或plasmolemma）位于细胞壁内层，具有从培养基中摄取营养，防止细胞质中低分子化合物的泄漏以及排泄代谢产物以防止其在细胞内积累过量的作用，所以它是一层半透性膜。此外，在细胞生长时，它还具有储积细胞壁成分的功能。
酵母细胞膜约8nm厚。在透射电子显微镜下观察细胞膜的超薄切片，可以发现较暗的电子密集层被一个较亮的电子透明层所分开。暗层可能代表蛋白质，亮层则代表脂和磷酸。中间层的中心可能由非极性的基因和它的磷酸极性基因的边缘部分所组成。另外还含有与溶质进出和酶的作用有关的蛋白质。在膜中最突出的酶是依赖于Mg2+的ATP酶，它在pH值中性时具有活性。此酶具有运送某些溶质进出细胞的活性。
细胞膜上具有许多深度超过50nm的凹折部分。膜表面还有组成甘露聚糖和蛋白质颗粒的特殊结构，其直径约为15nm，具有18nm的晶格的六面体排列。这些颗粒可以通过膜运动，并涉及细胞壁的甘露聚糖-蛋白质杂合物或微纤维的形成。
（四）细胞核
酵母细胞核由一种光学稠密的核仁部分和较多的含有染色物质的半透明部分组成，其外面有双层细胞核膜，形成一个完整的与细胞质间隔清楚的部分。酵母细胞中的细胞核（nucleus）在光学显微镜下是不易观察到的。但当酵母生长在含有18％～21％明胶的培养基中时，用相差显微镜即可观察到。
细胞核中除了DNA外，还含有不同种类的RNA和一种具有20～40个磷酸残基的链状聚磷酸盐。这种盐在RNA合成时是积累的，但它在核中的确切功能还不清楚。核仁是核糖体RNA的合成位点。在单倍体酵母属细胞中DNA总量约为1.2×1010～1.4×1010Da（1Da＝1.66054×10-27kg），约80％～90％的DNA含于核中。在双倍体酵母属中，在减数分裂和产孢子时，有17条独自分开的结合于中心粒的基因群。该数大致为这种酵母的单倍阶段的整个染色体数。其他酵母的染色体较少，例如，有两种汉逊酵母的单倍体细胞含有3条染色体，而异常汉逊酵母只有2条。
细胞核在繁殖和遗传上起着重要作用。
（五）诞生痕和出芽痕
诞生痕（birth scar）是子细胞与它的母细胞分离时子细胞的细胞壁上的位点，它通常在细胞长轴的末端。出芽痕（bud scar）是指母细胞壁上出芽并与子细胞分开的那个位点（图2-68）。
由于多重出芽，致使酵母细胞出芽痕在细胞表面稍微突起，围绕的中心区约为3 μm3。每个细胞的出芽数量是有限的，一个酿酒酵母细胞通常可出20个芽，多的可达40个。 |
图2-68 诞生痕和出芽痕 |
（六）微丝
近来，人们在酵母细胞表面观察到一种像头发丝一样的“微丝”（fimbriae）。这些微丝的直径为5～7nm，长度为0.1μm，其主要成分是蛋白质。在酵母属中，这些短的微丝与酵母的凝聚性有关。
（七）液泡
在显微镜下观察酵母细胞时，经常能看到直径约0.3～3μm的一个或多个大小不等的液泡（vacuole），这在酵母的生长平衡期，即处于不繁殖状态时特别明显。液泡一般呈球形，在光束照耀下，液泡较环绕着它们的细胞质更透明（图2-69）。
当细胞接入新鲜培养基中并开始发芽时，一个大液泡被分隔成几个小液泡；当芽发育时，液泡被分配到母细胞和子细胞中。出芽完成后，小液泡可以接合并再一次形成大液泡。
电子显微镜观察可发现，液泡被一单层膜所包围，膜的内外表面被直径为8～12nm的颗粒所覆盖。这些颗粒的功能还不清楚，但它具有转移液泡中储藏物质的作用。
分子量不同的各种成分都能进入液泡。液泡中有相当浓度的异染色粒，这种偏磷酸盐的聚合度在2～10之间。液泡也能积累低溶解度的某些嘌呤和其衍生物（如尿酸），这使得某些酵母菌如毕赤氏酵母常形成明显的液泡结晶，这些结晶体通常做布朗运动。大部分酵母的游离氨基酸也储藏于液泡中。液泡也可作为若干水解酶类的储藏体，包括蛋白酶、核糖核酸酶和酯酶。
若液泡破碎，可使细胞自溶。 |
图2-69 酵母细胞液泡 |
（八）线粒体
在酵母属中，线粒体（mitochondria）一般都位于紧靠细胞的四周。红酵母属是一种专性呼吸型酵母，它们的线粒体则随机地分布在细胞质中，其直径在0.3～1μm之间，长度为0.5～3μm或更长。每个细胞有1～20个线粒体。在出芽时，线粒体变得像丝状，并可分枝，之后分裂并进入子细胞。
线粒体（图2-70）外有一层内膜和一层外膜，内膜形成新的脊并扩展到线粒体的基质内。膜系统中有许多脂类、磷脂和麦角甾醇，还含有DNA和蛋白质，包括RNA聚合酶和若干参与三羧酸循环和电子传递的呼吸酶类。线粒体的主要功能是细胞内氧化能的转换，所以它是酵母细胞的“动力车间”。 |
图2-70 线粒体电镜切片图和结构模式图 |
线粒体的DNA量约占细胞的DNA总量的5％～20％。它虽能编码若干呼吸酶，但线粒体的一些结构蛋白质和细胞色素C是由核DNA编码的。
在厌氧的培养条件下，或在葡萄糖浓度高（5％～10％）的好氧条件下，线粒体会分解成一种嵴很差的前线粒体，这种细胞不再会合成细胞色素aa3和B，因而缺乏呼吸能力。但这种呼吸能力可在含非发酵性质的培养基中除去葡萄糖和通入空气而得到恢复。
酿酒酵母也可能完全丧失呼吸能力。这种失去呼吸能力的细胞可自然变异产生，比例可达1％～10％。这种变株在培养皿上形成小菌落，可以识别。
(九)内质网
内质网（endoplasmic reticulum）一部分与核外膜联结，另一部分则与细胞膜紧密结合。内质网的二膜间的距离约为20nm，此空间内充满了液汁或细胞汁。有膜包围住稠密的直径约为100nm的球体。
内质网膜的细胞质表面具有特殊的结构，一些丛状颗粒由聚核糖体组成，它们是合成蛋白质的中心。内质网还与出芽起始有关。
（十）细胞质内含物质（cytoplasmic ground substance）
1.脂肪粒（lipid globule）
大多数酵母细胞含有少量的球体（图2-71），它们是可用脂肪染料染色的脂肪，如可用苏丹黑或苏丹红将其染成黑色或红色。
当生长在含有限量氮源的培养基中时，一些菌种能大量地积累脂肪物质，有的可为细胞干重的50％～60％。如红酵母（Rhodotorula glutinis）含有颇多的不同大小的脂肪球；油脂酵母（Lipomycesarkeyi）和美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）通常含有一个或两个很大的脂肪球。
2.核糖体（ribosome） |
图2-71 脂肪粒 |
酵母的RNA含量很多，比DNA多5～100倍，达细胞干重的5％～12％。而核糖体中的RNA量占酵母中RNA总量的85％以上。细胞中的多数核糖体都固定在信息RNA分子上和核糖体的多聚体复合物中，这些复合物在多肽合成中起着重要的作用。
3.聚磷酸盐（polyphosphate）
在紧接细胞膜的细胞质内存在聚合度为300～500的聚磷酸盐。它们是作为高能磷酸盐储藏的，可存在于不同的代谢过程（如糖的运转和细胞壁多糖的生物合成）中。
4.肝糖（polysaccharide glycogen）
肝糖是酵母中储藏的两种主要糖类之一。其分子质量较高，约为107Da。肝糖由-树状的分子组成，主链的葡萄糖残基以（1→4）键相结合，分枝由α（1→6）键构成，分枝点间大约有12～14个葡萄糖残基。酵母的肝糖含量因菌种和生长条件的不同而有很大变化。当氮源不足而限制了生长，但仍有糖时，肝糖主要在平衡生长期积累。面包酵母含有干重12％的肝糖，若用碘液将其染成暗棕色，则可发现它是直径约为40nm的球形颗粒的集合体。
5.海藻糖（trehalose）
这种非还原性的双糖是酵母中储藏的第二种糖类。它的量既可以少到忽略不计，也可以高到16％，主要看酵母处于什么样的生长期。这种糖储藏在与膜结合的泡囊中，以避免已成为溶解性的海藻糖被水解。
此外，在细胞质中还存在大约1％～5％的酵母DNA，它们可能与膜含有的成分相结合，称之为2μm环状DNA质粒，其分子质量为5×106Da。它的确切作用尚不清楚。 |
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