近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌生产的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键技术之一。
第一节 重组DNA实验准则
关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。
1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，美、日等国都制定了有关DNA重组实验的准则，即在试管内用酶等构建异种DNA的重组分子，并用它转入活细胞中的实验，以及使用重组体的实验应遵循的规程。其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1～P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。
物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20 L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求采用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时采用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。
企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：① 使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置；② 培养装置的排气由除菌器排出；③ 使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。
第二节 基因重组菌的培养特点及控制
从本质上讲，基因重组菌的培养与普通微生物的好氧培养并无两样，但也有其特点。从培养工程的角度应考虑的主要因素有：营养源浓度的控制(碳源、氮源、氨基酸、溶氧等)、解除抑制生长的代谢产物；从生物学上要考虑：质粒的稳定性、质粒拷贝数的控制、转录效率的提高与控制、翻译效率的提高以及向菌体外的分泌等主要因素。
一、营养源浓度的控制
培养基因重组菌至少要遵守P1级的规定，所以必须进行高浓度菌体的培养。据报道，培养大肠杆菌最高产率为125 g干菌体／L；酿酒酵母为145 g干菌体／L。对于枯草杆菌的培养几乎尚未研究，估计可得20 g干菌体／L。，这些数值并非培养重组菌的结果，仅供参考。从培养工程的观点看，用枯草杆菌不太合适，即使要用，也必须是具有高效分泌产物的系统的种类。
从生物安全性考虑，基因重组菌是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。由于对维生素的需要量极微，故可在培养开始时仅添加必需量；即使过量也无影响。为了培养菌体达到高浓度，培养一开始就加入必需量的氨基酸，如过量将抑制菌的生长。为此可采用在调pH的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。这样在整个培养期间，葡萄糖与氨基酸的浓度几乎保持恒定。如此培养大肠杆菌C600株时获得了60 g干菌体／L。菌体对葡萄糖及氨基酸的收率因培养条件不同而异。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸和色氨酸为营养源时，平均每克所获干菌体量分别为0.3、2.5、15、40、40 g。以获取1 g干菌体所需营养源的价格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此，要避免用苏氨酸缺陷型作基因重组用的宿主菌，最好使用维生素缺陷型菌株。
二、质粒的不稳定性及其控制
在重组菌工业化生产研究中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢；生长速率的降低与所带质粒的大小成正比。此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致缓慢生长或异常生长。因此，在一个典型的工业发酵过程中所出现的大量子代中，对已丧失(分离性不稳定)或部分丧失(结构性不稳定)质粒的细胞有很强的选择作用，导致产率的逐渐下降。
㈠ 质粒不稳定的类型
质粒不稳定性有两种类型，一是分离性不稳定，这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。二是结构性不稳定，这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。
结构性不稳定一般是重组质粒发生缺失，缺失有3种情况：① 缺失发生在质粒复制起始区及选择性标记以外。这种情况往往使得工程菌仍带有选择性标记但不能正常表现目的基因的表型。② 缺失发生在质粒的选择性标记区域。例如Alexis Harington等人在研究重组质粒pVC102(amy+ NmR CmR)的稳定性时分离到amy- NmR CmS型质粒。如果重组质粒只有单一的选择性标记时，这种情况会被误认为质粒丢失。③ 缺失可能会发生在质粒复制的起始区。这种情况会导致整个质粒丢失。Alexis Harington发现质粒pVC102的大量丢失发生在菌体生长的停滞期而不是在对数生长期，因此他认为质粒pVC102在这一时期的丢失是因缺失延伸到复制起始区所致。
除了上述现象外，表达产物不稳定也是一个很重要的问题。华东化工学院曾作过一个实验，发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现，说明基因表达形成的产物也存在着稳定性的问题。
㈡ 影响质粒稳定的因素
重组质粒引入宿主后，引起宿主细胞和重组质粒之间的相互作用，在一定的环境中，其结果体现在在重组质粒上表达或不表达，重组质粒遗传稳定或不稳定，因此一个工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等3个方面。
⑴ 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响 为保证质粒在宿主细胞中能稳定地遗传，除了必须有复制控制系统外，还需要有一个在细胞分裂时适当的质粒分配系统，以保证质粒能正常地分配到子细胞中。一些质粒的分配系统在质粒上的位置已经确定。例如质粒pSC101的Hind II片段有复制功能，实验还证明该片段上还含有与质粒稳定性有关的序列，这一序列在0～0.27 kb之间，命名为分配定子(par)。质粒ColDF13有两个区段DNA——parA和parB，它们对该质粒的稳定起着不可缺少的作用质粒pAcyc184在无选择压力培养100代时丢失质粒的细胞占32％，而由pAcyc184构建的含par座位片段的pPM31在同样培养条件下未测到有丢失质粒的细胞。par座位可使与其无关的par-质粒稳定传代。将par座位插入到pBR322-trp上可使其质粒稳定性提高3～10倍。另外，par座位也可使低拷贝数质粒稳定。par座位的功能类似于真核细胞染色体上的着丝点，在细胞分裂时促进质粒分配，从而使质粒能稳定地传给子细胞。
⑵ 宿主对质粒稳定的影响 相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。枯草杆菌细胞内基因重组频率较高，可能是使质粒不稳定的一个原因。构建重组缺陷(rec-)的宿主细胞对一些质粒的稳定可能有利，例如Juan C.等研究了11种重组缺陷菌株对pUB110的影响，发现pUB110质粒在这些rec-细胞内都很稳定。
⑶ 质粒拷贝数 质粒拷贝数是可遗传质粒的函数，受所用的受体菌株生理和生长条件的强烈影响。重组蛋白质产生的数量随重组质粒拷贝数的增加而增加。质粒拷贝数还影响质粒稳定性，高拷贝系统比低拷贝系统更稳定。但高拷贝质粒会导致重组菌最大比生长速率μm减少，这样轻微的质粒分离性不稳定会导致重组细胞被无质粒细胞迅速取代。
⑷ 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 Singl研究质粒丢失和表达之间的关系，所使用的质粒编码色氨酸合成酶组分A，即trpA。trpA基因的表达为敏感P1启动子所控制。启动子的去抑制会引起无质粒细胞的迅速增加。外源基因表达水平愈高，重组质粒往往愈不稳定。如果基因表达得到控制，则重组质粒可能不会丢失。C. Parker等研究了含有酸性磷酸酯酶(AP)基因的2μ重组质粒的表达对其稳定性的影响。AP基因的表达由培养基中有机磷与无机磷的比例来控制。有机磷含量越高，AP基因表达越强，而质粒越不稳定。当培养基中只供给无机磷酸盐时，AP基因不表达，而质粒此时最稳定。
质粒表达使其稳定性受影响的原因可能是在质粒基因转录时影响了质粒的复制及分配，同时也影响了质粒的修复，这些因素使得质粒容易发生结构上的变化或丢失。另外，外源基因与染色体基因表达利用共同的起始因子、酶、核糖体、代谢能量及生物合成前体，这种竞争会导致重组菌的比生长速率低于无质粒细胞的比生长速率。
⑸ 重组菌与无质粒细胞的比生长速率之间的差别 在非选择条件下，含重组质粒细胞的比生长速率μ+往往小于不含重组质粒细胞的比生长速率μ-，其原因如⑷所述。假设μ-／μ+值为α，当α>1时，即使培养物每代时间内质粒丢失率很低，无质粒细胞也会很迅速地繁殖，使带有质粒的细胞所占细胞总数的百分比迅速下降。然而在目的基因产物与菌体代谢有直接关系时，通过控制发酵条件使得重组菌的比生长速率高于无质粒细胞的比生长速率也是完全可能的。
在培养环境中高温(如42 ℃以上)、去垢剂(如SDS等)、某些药物(如利福平、庆大霉素)、染料(如吖啶类、菲啶类)及胸腺嘧啶、饥饿、紫外线辐射等等都会引起质粒的丢失，因而常采取一些措施以防止或降低工程菌的不稳定性。
㈢ 使质粒稳定的措施
为了克服培养过程中重组质粒的丢失，可采取许多办法。在一项开发计划初期，有必要直接针对解决这个问题而作一些工作。其目的是为了在重组菌进入生产性试验阶段时，把放大时遇到的问题降到最低程度。主要包括以下几个方面：
⒈ 组建合适载体
常用质粒pBR322、pUB110在相应宿主中很稳定，如二者组成穿梭质粒或与外源片段进行重组后，常出现不稳定现象，如pC194是枯草杆菌中的一个常用质粒，亦较稳定；但在其Hind Ⅲ切口处插入一段DNA，形成的重组质粒的稳定性就差了。在无选择压力的情况下，经20世代后，含pC194的菌体占总菌体的99.5％以上，而重组质粒则有10％～80％被丢失，这是由于插入外源DNA后破坏了该质粒的稳定区。
YRp是能自主复制的酵母质粒，多拷贝但不稳定，即使有选择压力时，也有90％的质粒丢失，而以2μ组成的YEp，由于具有ori附近的稳定区，因而就稳定得多。
南开大学以B. licheniformis ATCC 27811为供体，以重组的质粒pNQ122为载体，用Hind Ⅲ切下的3.9 kb片段与之重组获得了pAMY41，但丢失率较高，后来他们将重组质粒EcoR I切去1.75 kb，质粒丢失率由95.4％下降到24％(pAMY411)，更换宿主后又降至3.0％，活力也从30倍提高到600倍。
⒉ 选择适当宿主
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
在选择宿主时，必须确定其遗传特点，这对工程菌的稳定性关系甚大，Imanaka等研究了质粒pSC101-trp在E. Coli W3110的3种不同突变型中的稳定性，结果见表11-1。
表11-1 宿主细胞对克隆菌稳定性的影响
据J. D. Vehmanpera和M. P. Korhola报道，对pUB110与重组质粒pKTH10在3种不同宿主中对培养50世代后的稳定性作了比较，表11-2中反映了它们的差异。对正常质粒pUB110而言，在3种宿主中都很稳定，而淀粉酶基因克隆菌pKTH10则有明显差异。
表11-2 不同宿主对质粒稳定性的影响
⒊ 施加选择压力
从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。在重组DNA技术中，有好几个方面利用选择压力，转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的分配性不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。
⑴ 抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因。将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，克隆菌也获得了抗药性。在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。但这种方法在大规模生产时并不可取。相对于简单培养基而言，加入大量的抗生素会使生产成本增加。对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间。例如，Apr基因通过编码β-内酰胺酶使氨苄青霉素(Ap)水解失活而使克隆菌具有抗药性，也正因为这一原因，只有在培养基中加入大量的Ap才能维持较长时间的选择压力。Meyerink等报道，带有Apr基因的克隆茵在Ap浓度分别为50、200、1000 μg／mL的培养基中培养16 h后，含有重组质粒的细胞占总细胞的40％、60％、100％。另外如前所述，添加抗生素对结构性不稳定无能为力。Dwivedi等报道，在含有四环素(Tc)的培养基中，克隆菌株W3110Tn8(pSC101-trp115.14)连续培养36 h后，重组质粒高度不稳定，绝大部分菌体能抗Tc，但不产色氨酸。
另外，该方法在发酵过程中会受到成本、产物提取等方面的限制。而且抗生素的存在易影响目的产物的合成。
⑵ 抗生素依赖变异法 日本的三轮清志等用抗生素依赖变异法代替上述抗生素添加法，取得了很好效果。其方法是通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株，即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长，因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能达到消除重组质粒分配性不稳定的目的。这种方法可以节省大量抗生素，具有实用价值。它的缺点是宿主细胞容易发生回复突变。
⑶ 营养缺陷型法 营养缺陷型法与上述抗生素依赖变异法相类似，其原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。例如构建带有色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trp，并在该质粒上插入SerB基因；而宿主细胞是SerB缺陷型，这样质粒与宿主形成互补，在培养过程中丢失质粒的细胞因不能合成Ser而被淘汰。
⒋ 控制基因过量表达
提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但许多研究中发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失，含有重组质粒的克隆细胞与不含重组质粒的宿主细胞的比生长速率可能相同。因此，可以采取两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。
⑴ 可诱导性启动子 在构建表达质粒时，可以使用可诱导性的操纵子，如lac、trp、P1等，在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）至一定时期，在此期间质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏(诱导)使质粒高效表达。例如利用3-β-吲哚乙酸可以使trp启动子去阻遏。
⑵ 温度敏感型质粒 一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增，这种质粒称“脱缰质粒”（runaway plasmid）。例如Uhlin等获得的质粒pKN402和pKN410在30 ℃时的拷贝数为20～50个／E. coli细胞，在35 ℃时质粒大量复制。将β-内酰胺酶基因接在上述质粒中，经热诱导后，β-内酰胺酶活力可扩增400倍。
⒌ 控制培养条件
克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大，对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚未得知。前面采取的施加选择压力和控制基因过量表达两种方法，其实也是通过培养条件的控制而实现的。在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤为重要。
⑴ 培养基的组成 微生物在不同的培养基中进行不同的代谢活动。对克隆菌来说，培养基组分可能通过各种途径影响质粒稳定地遗传。Imanaka等研究了两种培养基对克隆菌稳定性的影响，结果见表11-3。此表说明，质粒在丰富培养基PBB中比在最低限培养基（基本培养基）MM中更加不稳定，其不稳定的类型也不相同。培养基引起质粒RSF2124-trp结构性不稳定，而对质粒pSC101-trp来说，则是分配性不稳定。
表11-3 培养基对克隆菌稳定性的影响
⑵ 培养温度 重组质粒引入细胞后，引起细胞发生一系列生理变化。前面说过，带有重组质粒的克隆菌的比生长速率往往比宿主细胞小。同样，有报道重组质粒引起宿主细胞生长温度范围的变化：B. stearothermophilus的生长温度范围是40～70 ℃，而B. stearothermophilus(pLP11)的生长温度范围是40～63 ℃，由于重组质粒的导入，克隆菌生长温度范围的上限降低。
通常而言，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。对前述克隆菌而言，当培养温度低于50 ℃时，重组质粒非常稳定，而当温度高于50 ℃时，重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均不稳定。
⑶ 菌体比生长速率 菌体比生长速率反映了许多环境因素如培养基组成、温度、pH、溶氧传递等对菌体代谢的影响，因而就菌体比生长速率对重组质粒稳定性的影响的研究工作有许多报道。
比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。例如，在酵母系统中，比生长速率对质粒pJDB248稳定性的影响是，比生长速率大有利于重组质粒稳定地遗传。这种关系在细菌系统中也有报道，但在以氮为限制基质时就没有这一现象。
如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快，则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到，因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率。在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低α值，提高重组质粒的稳定性。
某些菌种利用碳水化合物作为碳源与能源时，如果基质浓度很低，则生长受到限制；如果基质浓度很高，则生长也受到抑制，这种情况往往是由于高浓度底物抑制了代谢途径中的某个酶。如果重组质粒上含有编码该酶的基因和目的基因，将重组质粒转入上述菌种后，克隆菌可能不再受高浓度碳源抑制。即宿主细胞遵循典型的底物抑制方程，克隆菌遵循Monod方程。当c(S)<c(S)o时，μ->μ+，不利于质粒稳定地遗传；而当c(S)>c(S)o时，μ-<μ+，有利于质粒稳定地遗传。在恒化培养时，基质浓度可以很容易地控制。
⑷ 缩短发酵周期 在此项技术中，重点并非是如何防止质粒的不稳定性，而是经动力学模型计算出可终止发酵的时间。此时如继续运转，在经济上已无利可图，应及时终止发酵，尽量缩短周期。
总之，在影响重组质粒稳定性的诸多因素中，宿主细胞的遗传特性、重组质粒的组成和克隆菌所处的环境条件等三方面更受人们的重视。就分子水平而言，影响某些质粒稳定性的基因顺序已经定位；从细胞水平来看，有可能选择一些具有特定遗传背景的细胞作为宿主以获得比较稳定的克隆菌。但这两方面的研究尚需从广度和深度上进一步继续下去，以期抽象其本质，从根本上提高重组质粒的稳定性。另一方面，在尚未彻底明瞭影响质粒稳定性的原因之际，从工程水平上来研究影响重组质粒稳定性的各种因素及其对发酵生产的影响是十分必要的。总之，重组质粒的稳定与否关系着重组DNA技术走向商业化之路的成败。对这一错综复杂的问题的解决，需要多方面的努力。质粒稳定性问题是涉及遗传及生理等多方面的问题，影响因素很多，在具体工作中要根据所研究的菌株特性提出解决质粒稳定性的方法。
三、转录效率和拷贝数的控制
选定什么样的菌为宿主菌是个重要问题。大肠杆菌是研究得最多且容易处理的菌，但除特殊场合以外，使其代谢产物分泌到培养基中还是很困难的。让枯草杆菌把代谢产物分泌出来是可能的，但由于产生孢子，难以培养到高浓度，而不产生孢子的变异株往往本身很难培养。越来越多的研究表明，使用其它微生物已成为可能，因此不仅要应用基础的重组技术，同时还应考虑到培养方法。
为了高效率地生产代谢产物，应考虑每个细胞的质粒数、质粒的稳定性及转录与翻译阶段的效率等。每个细胞的质粒数越多，编码在质粒上的目的产物的生产率越高。但因其质粒数多，其增殖速率比不保持质粒的菌株要慢，因此，不用抗生素等施加选择压力时，在有多次细胞分裂的大量培养中，就会产生质粒脱落株占优势，而且质粒数越多，质粒脱落的速率越高。因此可考虑用二阶段培养方式，即最初让质粒数在较低状态培养，等达到某种程度的高浓度后，再提高质粒数或转录、翻译阶段的效率。
提高培养温度有可能增加拷贝数，这一性质易于在工业规模的培养中应用。在前培养和主培养的中途改为低温培养时，拷贝数较少。其原因是给宿主的“负担”减少了，生长速率也提高了。在主培养中途提高培养温度，就能增加拷贝数，从而提高基因产物的产量。据报道，对于大肠杆菌已开发了温度敏感型的质粒和含有用药物能强力诱变的启动子领域的质粒，因此能实施异种DNA重组菌的二阶段培养。日本学者探讨了具有穿梭质粒pCP3的E. coli C600／pCI 857的培养条件，结果见图11-1。首先在25 ℃培养，使其浊度（OD值）达4，然后升温至37 ℃，发现此种方法的效果最佳。作为基因产物的β-内酰胺酶的活性增加约37倍。杉木等人发现了温度敏感型的质粒，并研究用此质粒生产苯丙氨酸，在40 ℃恒温下培养，其浓度可达19 g／L。
图11-1 温度敏感型质粒保持菌株的二阶段培养
虚线为培养温度由25 ℃提高到37 ℃的时间
另据报道，利用λ噬菌体PL启动子的温度敏感性，在双罐连续培养的第1罐于低温培养，以降低转录效率；第2罐于高温下培养，以提高转录效率，基因产物的产量得以提高。
这种二阶段培养也可用添加或去除药剂的方法来提高基因产物的产量。日本对在色氨酸启动子上连接β-半乳糖苷酶基因的质粒pMCT98进行了研究。加药剂法较易实施，先研究了3-β-吲哚乙酸(IAA)的添加时间与培养基组成的影响，但在发酵罐中的试验结果较差。为此，又采用了微孔陶瓷过滤器(孔径0.2 μm)的培养装置进行了去除药剂的研究，即开始在色氨酸存在下培养，使转录效率降低，生长浊度达10时，进行错流过滤，供给不含色氨酸的培养基，结果如图11-2所示。过滤开始后的15 min已测不出培养液中的色氨酸了，转录效率变高，β-半乳糖苷酶的比活性急剧增高。最终浊度达150(以干物质计约相当60 g／L)，β-半乳糖苷酶约占总蛋白质的8％。
图11-2 含色氨酸启动子的质粒保持菌株的二阶段培养
虚线表示进行过滤并供给不含色氨酸培养基的时间
基因重组菌培养工程的研究刚刚起步，随着发酵工程的飞速发展，人们也期待着重组菌的培养工程会有更大发展。
思考题
⒈ 简述重组DNA实验准则。
⒉ 简述基因重组菌的培养特点及控制措施。 |
