动植物（组织）细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH值、溶氧、CO2、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。相比之下，植物细胞对营养要求较动物细胞简单，但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计提出特殊的要求。
　　在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得。从20世纪50年代以来，这方面已取得一些进展。但是，目前的技术还远不能满足细胞生物产品应用的要求，随着动植物细胞培养技术研究的深入，该技术显示出广阔的发展前景。

第一节　动物细胞的培养

　　近年来，由于生物技术的发展，特别是细胞融合技术、DNA重组技术及基因表达调控技术的发展，使哺乳动物细胞表达系统成了一个更合适的生产目的产物的工具。在动物细胞中插入适当的基因，生产有用的药物将对制药工业产生很大的影响。动物细胞产品的医学应用，大大促进了动物细胞培养技术的发展。表10-1列出了动物细胞培养的产物及医学应用。
表10-1　动物细胞培养的产物及医学应用

一、动物细胞的形态
㈠ 贴壁依赖型细胞
　　⑴ 成纤维细胞型(fibrlblast或mechanocyte type)　这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，原生质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常借原生质突起连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行[如图10-1(a)]。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。实际上很多所谓成纤维细胞并无产生纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法。
　　⑵ 上皮细胞型(epithelium cell type)　这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片[如图10-1(b)]，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)、肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞，培养时皆呈上皮细胞型。
　　⑶ 游走细胞型(wondering cell type)　这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，原生质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速率快而且方向不规则[如图10-1(c)]。此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它也可能变为成纤维细胞型。
　　⑷ 多形性细胞型(polymorphic cell type)　除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归为多形性细胞型[如图10-1(d)]。

图10-1　动物细胞的形态
(a)成纤维细胞型；(b)上皮细胞型；(c)游走细胞型；(d)多形性细胞型
　　上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这一类型细胞时，常需贴附在支持物上生长。但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。
㈡ 悬浮型细胞
　　悬浮型细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞、淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类型细胞可采用微生物培养的方法进行悬浮培养。
二、确立细胞株
　　动物组织经物理切碎、切片，或者经化学法或酶法处理所得的原代细胞，一般经约50代分裂繁殖，便退化死亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞特性仍保持正常。这类细胞被称为初代培养细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现繁殖能力突然增强、几乎无限制繁殖的细胞。其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成等都发生了变化，完全失去原代细胞的特性。我们把这一类通常所说的癌细胞，称之为确立细胞株（或株化细胞、细胞系）。来源于小鼠的L细胞和来源于人子宫颈癌的Hela细胞就是有名的确立细胞株。
　　绝大部分初代培养细胞只能附着在容器壁上进行繁殖，形成单层状细胞层，因此称为贴壁依赖型细胞。用胰蛋白酶处理这个细胞层，又可分散成单细胞，如果继续培养又可形成单细胞层。我们把这种操作称为移植继代培养。但这类细胞与确立细胞株不一样，不能无限繁殖，人胚胎组织的细胞经过50次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细胞称为细胞株（或传代细胞）。这类细胞在繁殖初期也有形态变化，经过几代反复分裂繁殖后，只有一种能继续繁殖的叫做成纤维细胞，其他形状的细胞就消失了。通常这些成纤维细胞在50代之内染色体是正常的。成纤维细胞的繁殖过程是，开始于初代培养细胞期，随着世代的增加进入对数期，大约经过30～50代的繁殖，生长速度就变缓慢，进入衰减期，这时细胞分裂繁殖就完全停止，继而死亡。在此繁殖过程中可能出现有少部分细胞发生变异的确立细胞株。
　　成纤维细胞在衰减期之前，大部分不具癌化性，仍保留初代培养细胞的性质，因此非常安全可靠。如果从中采集繁殖10～20代的细胞作种细胞，冷冻保存在-80 ℃，供作生产疫苗、尿激酶、干扰素等的组织细胞培养的种细胞是可行的。
　　确立细胞株的根本特点是其染色体为非整倍体或亚二倍体，细胞在培养中不再有接触抑制的特性，属悬浮型细胞，一般都显示非常稳定的繁殖特性，可以无限增殖，在大多数情况下，可用于大量悬浮培养。然而，它具有癌化性质，用来生产疫苗之类物质是带有一定的危险性。可是，近代分离纯化技术的进步，有可能除去夹杂的有害物质，因此用确立细胞株生产有用物质是完全可能的。例如：1982年用来自淋巴瘤的确立细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。
三、培养基的组成
　　动物细胞能在体外传代和繁殖，这个发现促使人们找到化学成分更加确定的培养基以维持细胞连续生长和替代“天然”培养基，如胚胎提取物、蛋白质水解物、淋巴液等。常用的Eagle基本培养基和更复杂的DMEM培养基，199培养基，RPMI 1640培养基和CMRL 1066培养基，虽然是化学合成的，但仍添加5％～20％血清，如表10-2所示。虽然针对特定细胞和培养条件寻找专用培养基已经过多年的不懈研究，但选择培养基仍无章可循，常凭经验，开发出的培养基并不能满足各种动物细胞的更严格的要求。
表10-2　动物细胞培养基的组成

动物细胞培养基的常用成分如下：
　　⑴ 氨基酸　必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必需氨基酸，另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不同。有时也加入其他非必需氨基酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可影响细胞存活和生长速率。在细胞培养中，大多数动物细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源。
　　⑵ 维生素　Eagle基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血清中取得。血清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，一些维生素也必不可少。维生素对细胞培养的限制可从细胞存活和生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标。
　　⑶ 盐　盐中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透压的主要成分。对悬浮培养，减少钙可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相CO2浓度有关。
　　⑷ 葡萄糖　多数培养基都含有葡萄糖以作能源。它主要经糖酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转化成乳酸或乙酰乙酸进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞，乳酸在培养基中的积累特别明显，即说明不是像体内那样完全由柠檬酸循环发挥作用。
　　⑸ 有机添加剂　复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类及其他各种化合物。同样，当血清量减少时，必须添加这类化合物，它们对克隆和维持这些特殊动物细胞有益。
　　⑹ 血清　组织细胞培养中常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的蛋白质、核酸、激素等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，黏附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。最常用的是小牛血清、胎牛血清，人血清用于一些人细胞系。
　　大多数动物细胞培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，动物细胞可在无血清条件下维持和增殖。
四、培养基制备应考虑的因素
　　⑴ pH值　多数细胞系在pH7.4下生长得很好。尽管各细胞株之间细胞生长最佳pH值变化很小，但一些正常的成纤维细胞是以pH7.4～7.7最好，转化细胞以pH7.0～7.4更合适。据报道，上皮细胞以pH5.5合适。为确定最佳pH值，最好做一个简单的生长实验或特殊功能分析。
　　酚红常用作指示剂，它在pH7.4呈红色，pH7.0呈橙色，pH6.5呈黄色，而pH7.6呈红色中略带蓝色，pH7.8呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性，因而必须用无菌平衡盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准样，放在与制备培养基相同的瓶子中。通过观察培养基颜色变化，及时掌握其pH值变动。
　　⑵ 缓冲能力　碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低、对培养物有营养作用，因此比其他缓冲系统用得多。但它在正常生理pH7.40±0.05条件下的缓冲能力差。
　　⑶ 渗透压　多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受范围，一般常用冰点降低或蒸汽压升高现象测定培养基渗透压。如果自己配制培养基，可通过测定其渗透压防止称量和稀释等造成的误差。
　　⑷ 黏度　培养基的黏度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么影响。在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的黏度，可减轻对细胞的损害，这对在低血清浓度或无血清条件下培养细胞显得尤为重要。
五、细胞培养的环境要求
　　动物细胞的生长代谢在很大程度上受环境因素的影响，如培养基的成分、细胞生长的支持物、气体交换和培养温度等。
　　⒈ 支持物
　　体外培养的大多数动物细胞需在人工支持物上单层生长。在早期的实验中，用玻璃作为支持物，开始是由于它的光学特性，后来发现它具有合适的电荷，适合于细胞贴壁生长。
　　⑴ 玻璃　玻璃常用作支持物。它很便宜，容易洗涤，且不损失支持生长的特性，可方便地用于干热或湿热灭菌，透光性好，强碱虽然可使玻璃产生对培养的不良影响，但用酸洗中和后即可消除。
　　⑵ 塑料制品　一次性的聚苯乙烯瓶是一种方便的支持物。但制成的聚苯乙烯是疏水性的，不适合于细胞生长，所以细胞培养用的聚苯乙烯瓶要用γ射线、化学药品或电弧处理使之产生带电荷的表面，具有可润湿性。聚苯乙烯的光学性质好，培养表面平整。除此之外，细胞也可在聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和其他塑料上生长。
　　⑶ 微载体　大规模动物细胞贴壁培养最常用的支持物是微载体。其材料有聚苯乙烯、交联葡萄糖、聚丙烯酰胺、纤维素衍生物、几丁质、明胶等。微载体的制备是一种较复杂的技术，通常用特殊的技术制成100～200 μm直径的圆形颗粒，微载体的价格一般也比较贵。但它的最大优点是可使贴壁依赖型细胞进行悬浮培养。微载体表面及表面深层光滑，并带有少量正电荷，适合于细胞贴附。微载体大都是一次性的，不能重复使用。
　　支持物通过各种预处理后，可改善细胞的贴壁生长性能。用过的玻璃容器比新的更适合细胞生长，这可能归因于细胞培养后的玻璃表面的蚀刻和剩余的微量物质，细胞的生长也可以改善玻璃表面以利第二次接种，该微量物质可能是细胞释放出的胶原或黏素。
　　⒉ 气体交换
　　⑴ 氧气　气相中的重要成分是氧气和二氧化碳。各种动物细胞培养对氧的要求不同，大多数培养适合于大气中的氧含量或更低些。据报道，对培养基中硒含量的要求与溶氧浓度有关，硒有助于除去呈自由基状态的氧。在大规模细胞培养中，氧可能成为细胞密度的限制因素。
　　 ⑵ 二氧化碳　二氧化碳对动物细胞培养起着相对复杂的作用，气相中的CO2浓度直接调节溶解态CO2的浓度，溶解态的CO2受温度影响，CO2溶于培养基中形成H2CO3，产生的H2CO3又能再离解：

图10-3　典型的分批培养随时间的变化曲线
⒉ 流加式培养
　　流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断生成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。流加式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。

图10-4　流加式培养过程的特征
　　流加式培养过程的特征如图10-4所示。流加式培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度：一方面，它可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成；另一方面，它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。同时在流加式培养过程中，由于新鲜培养液的加入，整个过程的反应体积是变化的。
　 　根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式：无反馈控制流加和有反馈控制流加。无反馈控制流加包括定流量流加和间断流加等；有反馈控制流加一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。
⒊ 半连续式培养
　　半连续式培养是在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。
⒋ 连续式培养
　　连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。与分批式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处环境条件长时间地稳定，可以使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的生长和产物的生成。由于连续式培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养悬浮型细胞。
　　动物细胞的连续培养一般是采用灌注培养。灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续往反应器中加入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养恒定的状态。高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞足够的营养以及除去有毒的代谢物。通过调节添加新鲜培养液的速度，使培养保持在稳定的、代谢副产物低于抑制水平的状态。采用此法，可以大大提高细胞的生长密度，有助于产物的表达和纯化。
七、动物细胞大规模培养的工艺
　　 大规模动物细胞培养的工艺流程如图10-5所示，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理得到单个细胞，收集细胞并离心。获得的细胞植入营养培养基中，使之增殖至覆盖瓶壁表面，用酶把细胞消化下来，再接种到若干培养瓶以扩大培养，获得的细胞可作为“种子”进行液氮保存。需要时，从液氮中取出一部分细胞解冻，复活培养和扩大培养，之后接入大规模反应器进行产物生产。需要诱导的产物或者病毒感染后才能得到产物的细胞，需在生产过程中加入适量的诱导物或感染病毒，再经分离纯化获得目的产物。

第二节　植物细胞的培养

　　植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规模的悬浮培养可利用发酵罐生产。
　　植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(包括遗传的全能性和发育的全能性，而动物细胞除卵子具有上述两性外，其余细胞仅具有遗传的全能性)，该论断成为植物组织培养的开端。其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。20世纪30年代，组织培养取得了飞速的发展，细胞在植物体外生长成为可能。1939年Gautheret、Nobercourt、White分别成功地培养了烟草、萝卜的细胞，至此，植物组织培养才真正开始。50年代，Talecke和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长在悬浮培养基中。自1956年Nickell和Routin第一个申请用植物组织细胞培养产生化学物质的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生代谢产物（或称次级代谢产物）的研究取得了很大的进展。随着生物技术的发展，细胞原生质体融合技术使植物细胞的人工培养技术进入了一个新的更高的发展阶段。借助于微生物细胞培养的先进技术，大量培养植物细胞的技术日趋完善，并接近或达到工业生产的规模。
　　植物细胞培养能生产一些微生物所不能合成的特有代谢产物，如生物碱类(尼古丁、阿托品、番茄碱等)、色素(叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等)、类黄酮和花色苷、苯酚、皂角苷、固醇类、萜类、某些抗生素和生长控制剂(赤霉素等)、调味品和香料等。细胞培养用于种苗生产，如兰花等名贵花卉和谷物良种的培育可不受外界环境的影响。人们期望有一天可以实现将豆科植物的共生固氮基因转移到非豆科作物中去，使原来不能与根瘤菌共生固氮的禾本科植物变成能固氮植物，从而不再需要氮肥供给。表10-3列出了有工业化前途的植物细胞培养产物。
表10-3　工业化生产的植物细胞培养产物

一、植物细胞培养流程 　　植物细胞培养与微生物细胞培养类似，可采用液体培养基进行悬浮培养。植物组织细胞的分离，一般采用次亚氯酸盐的稀溶液、福尔马林、酒精等消毒剂对植物体或种子进行灭菌消毒。种子消毒后在无菌状态下发芽，将其组织的一部分在半固体培养基上培养，随着细胞增殖形成不定形细胞团(愈伤组织)，将此愈伤组织移入液体培养基振荡培养。如植物体也可采用同样方法将消毒后的组织片愈伤化，再用液体培养基振荡培养，愈伤化时间随植物种类和培养基条件而异，慢的需几周以上，一旦增殖开始，就可用反复继代培养加快细胞增殖。
　　继代培养可用试管或烧瓶等，大规模的悬浮培养可用传统的机械搅拌发酵罐、气升式发酵罐。其流程见图10-7。植物细胞培养系统可以粗略地分为固体培养方式和液体培养方式，每种培养方式又包括若干种方法，见图10-8。

图10-7　植物细胞的大规模培养流程

图10-8　植物细胞的培养系统

二、植物细胞培养基的组成
　　植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基的成分由碳源、有机氮源、无机盐类、维生素、植物生长激素和有机酸等物质组成。常用的植物细胞培养基的组成见表10-4。
表10-4　常用的植物细胞培养基配比　　　单位：mg／L

　　⑴ 碳源　蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前二者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。
　　⑵ 有机氮源　通常采用的有机氮源有蛋白质水解物(包括酪蛋白质水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。
　　⑶ 无机盐类　对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中无机盐的浓度应在25 mmol／L左右。硝酸盐浓度一般采用25～40 mmol／L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20 mmol／L，磷、镁、钙和硫元素的浓度在1～3 mmol／L之间。
　　⑷ 植物生长激素　大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。植物生长激素分成两类：生长素和分裂素。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸和奈乙酸。分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤(BA)和玉米素(Z)。分裂素和生长素通常一起使用，促使细胞分裂、生长。其使用量在0.1～10 mg／L之间，根据不同细胞株而异。
　　⑸ 有机酸　加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10 mmol／L。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。
　　⑹ 复合物质　通常作为细胞的生长调节剂如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是1～15 mmol／L。
三、植物细胞培养的方法
　　植物细胞培养的方法有单倍体培养，原生质体培养，固体培养、液体培养，悬浮培养和固定化培养。
　　⑴ 单倍体细胞培养　主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。
　　⑵ 原生质体培养　植物的体细胞(二倍体细胞)经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的除去细胞壁的细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最终可以长成植株。实际过程中，也可以用不同植物的原生质体进行融合，达到体细胞杂交的目的，由此可获得细胞杂交的植株。
　　⑶ 固体培养　固体培养是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养基的凝固剂除去特殊研究的外，几乎都使用琼脂，浓度一般为2％～3％，细胞在培养基表面生长。原生质体的固体培养则需将其混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体-液体之间进行双相培养。
　　⑷ 液体培养　液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养可分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床使培养物和培养基保持充分混合以利于气体交换。
　　⑸ 悬浮培养　植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培养条件下才能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。
　　⑹ 固定化培养　固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。
四、植物细胞的大规模培养技术
　　目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。
　　㈠ 植物细胞的大规模悬浮培养
　　悬浮培养通常采用水平振荡摇床，该摇床可变转速为30～150 r／min，振幅2～4 cm，温度24～30 ℃。适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬浮细胞培养。悬浮培养的关键就是要寻找适合于悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散和保持分化再生能力的培养基。
　　⒈ 悬浮培养中的植物细胞的特性
　　由于植物细胞有其自身的特性，尽管人们已经在各种微生物反应器中成功进行了植物细胞的培养，但是植物细胞培养过程的操作条件和微生物培养的是不同的。与微生物细胞相比，植物细胞要大得多，其平均直径要比微生物细胞大30～100倍。同时植物细胞很少是以单一细胞形式悬浮存在，而通常是以细胞数在2～200之间，直径为2 mm左右的非均相集合细胞团的方式存在。根据细胞系来源、培养基和培养时间的不同，这种细胞团通常由以下几种方式存在：① 在细胞分裂后没有进行细胞分离；② 在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌多糖和蛋白质，黏合成细胞团；③ 以其他方式形成黏性表面，从而形成细胞团。当细胞密度高、黏性大时，容易产生混合和循环不良等问题。表10-5是动植物细胞、微生物细胞培养的特征比较。
表10-5　动植物、微生物细胞的培养特征

　　由于植物细胞的生长速度慢，操作周期就很长，即使间歇操作也要2～3周，半连续或连续操作更是可长达2～3个月。同时由于植物细胞培养基的营养成分丰富而复杂，很适合于真菌的生长。因此，在植物细胞培养过程中，保持无菌是相当重要的。
　　⒉ 植物细胞培养液的流变特性
　　由于植物细胞常常趋于成团，且不少细胞在培养过程中容易产生黏多糖等物质，使氧传递速率降低，影响了细胞的生长。对于植物细胞培养液的流变特性的认识目前还是很肤浅的，人们常用黏度这一参数来描述培养液的流变学特征。培养过程中培养液的黏度一方面由细胞本身和细胞分泌物等决定，另一方面还依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。在相同的浓度下，大细胞团的培养液的表观黏度明显大于小细胞团的培养液的表观黏度。
　　⒊ 植物细胞培养过程中的氧传递
所有的植物细胞都是好氧性的，需要连续不断地供氧。由于植物细胞培养时对溶氧的变化非常敏感，太高或太低均会对培养过程产生不良地影响，因此，大规模植物细胞培养对供氧和尾气氧的监控十分重要。与微生物培养过程相反，植物细胞培养过程并不需要高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。
　　氧气从气相到细胞表面的传递是植物细胞培养中的一个基本问题。大多数情况下，氧气的传递与通气速率、混合程度、气液界面面积、培养液的流变学特性等有关，而氧的吸收却与反应器的类型、细胞生长速率、pH值、温度、营养组成以及细胞的浓度等有关。通常也用液相体积氧传递系数(KLɑ)来表示氧的传递，事实证明液相体积氧传递系数能明显地影响植物细胞的生长。
　　培养液中通气水平和溶氧浓度也能影响到植物细胞的生长。长春花细胞培养时，当通气量从0.25 L／(L·min)上升至0.38 L／(L·min)时，细胞的相对生长速率可从0.34 d-1上升至0.41 d-1；而当通气量再增加时，细胞的生长速率反而会下降。曾在不同溶氧浓度时对毛地黄细胞进行了培养，当培养基中氧浓度从10％饱和度升至30％饱和度时，细胞的生长速率从0.15 d-1升至0.20 d-1，如果溶氧浓度继续上升至40％饱和度时，细胞的生长速率却反而降至0.17 d-1。这就说明过高的通气量对植物细胞的生长是不利的，会导致生物量的减少，这一现象很可能是高通气量导致反应器内流体动力学发生变化的结果，也可能是由于培养液中溶氧水平较高，以至于代谢活力受阻。
　　由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对细胞的生长同样相当重要。研究发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2，如在空气中混以2％～4％的CO2能够消除高通气量对长春花细胞生长和次级代谢产物产率的影响。因此，对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时，CO2和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培养有时需要通入一定量的CO2气体。
　　⒋ 泡沫和表面黏附性
　　植物细胞培养过程中产生泡沫的特性与微生物细胞培养产生的泡沫是不同的。植物细胞培养过程中产生的气泡比微生物培养系统中的气泡大，且被蛋白质或黏多糖覆盖，因而黏性大，细胞极易被包埋于泡沫中，造成非均相的培养。尽管泡沫对于植物细胞来说，其危害性没有对微生物细胞那么严重，但如果不加以控制，随着泡沫和细胞的积累，也会对培养系统的稳定性产生很大的影响。
　　⒌ 悬浮细胞的生长与增殖
　　由于悬浮培养具有三个基本优点：① 增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；② 可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；③ 保证氧的充分供给。因此，悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。

图10-9　悬浮培养时细胞的生长曲线
　　悬浮培养时细胞的生长曲线如图10-9所示，细胞数量随时间变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延滞期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短因植物种类和起始培养细胞密度的不同而不同。在植物细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。
　　⒍ 细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生
　　悬浮培养的单个细胞在3～5 d内即可见细胞分裂，经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后，将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，三星期后可分化成试管苗。
　　㈡ 植物细胞或原生质体的固定化培养
　　由于固定化植物细胞比自由细胞悬浮培养有较多的机械性、较高的产率、更长的稳定期(即生产期)等许多优点。因此，通常采用固定化技术进行细胞培养，即植物细胞固定化和原生质体的固定化培养。
　 　植物细胞的固定化常采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂糖和琼脂材料，均采用包埋法，其他方式的固定化植物细胞很少使用。原生质体比完整的细胞更脆弱，因此，只能采用最温和的固定化方法进行固定化，通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。
五、影响植物细胞培养的因素
　　植物细胞生长和产物合成动力学也可分为三种类型：① 生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；② 中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合成也停止；③ 非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢产物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。此外，不同的环境条件对产物合成的动力学也有很大的影响。
　　⒈ 细胞的遗传特性
　　从理论上讲，所有的植物细胞都可看做是一个有机体，具有构成一个完整植物的全部遗传信息。在生化特征上，单个细胞也具有产生其亲本所能产生的次生代谢产物的遗传基础和生理功能。但是，这一概念决不能与个别植株的组织部位相混淆，因为某些组织部位所具有的高含量的次生代谢产物并不一定就是该部位合成的，而有可能是在其他部位合成后通过运输在该部位上积累的。有的植物在某一部位合成了某一产物的直接前体而转运到另一部位，通过该部位上的酶或其他因子转化成产物。因此，在进行植物细胞的培养时，必须弄清楚产物的合成部位。同时，在注意到整体植物的遗传性时，还必须考虑到各种不同的细胞。
　　⒉ 培养环境
　　由于各类代谢产物是在代谢过程的不同阶段产生的，因此通过植物细胞培养进行次生代谢产物生产所受的限制因子是比较复杂的。各种影响代谢过程的因素都可能对代谢产物生产发生影响，这些因素主要有光、温度、搅拌、通气、营养、pH值、前体和调节因子等。
　　⑴ 温度　植物细胞培养通常是在25 ℃左右进行的，因此一般来说在进行植物细胞培养时很少考虑温度对培养影响。但是实际上，无论是细胞培养物的生长或是次生代谢产物的合成和积累，温度都是起着一定的作用，需要引起一定的重视。
　　⑵ pH值　植物细胞培养的最适pH值一般在5～6。但由于在培养过程中，培养基的pH值可能有很大的变化，对培养物的生长和次生代谢产物的积累十分不利，因此需要不断调节培养液的pH值，以满足细胞的生长和产物代谢、积累的需要。
　　⑶ 营养成分　尽管植物细胞能在简单的合成培养基上生长，但营养成分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养成分一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。一般地说增加氮、磷和钾的含量会使细胞的生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物。
　　⑷ 光　光照时间的长短、光的强度对次生代谢产物的合成都具有一定的作用。一般来说愈伤组织和细胞生长不需要光照，但是光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。有人研究了光对黄酮化合物形成的影响，结果表明，培养物在光照特别是紫外光下积累黄酮及黄酮类醇糖苷的所有酶活性均增加。通常光照采用荧光灯，或者荧光灯和白炽灯混合，其光强度是300～10000 lx(6～100 μm／m2·s)，可以连续光照，也可以每天光照12～18 h。
　　⑸ 搅拌和通气　植物细胞在培养过程中需要通入无菌空气，适当控制搅拌程度和通气量，在悬浮培养中更要如此。在烟草细胞培养中发现，如果KLɑ≤5 h-1，对生物产量有明显抑制作用。当KLα=5～10 h-1，初始的KLα和生物产量之间有线性关系。当然不同的细胞系，对氧的需求量是不相同的。为了加强气-液-固之间的传质，细胞悬浮培养时，需要搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆，对搅拌的剪切力很敏感，在摇瓶培养时，摇床振荡范围在100～150 r／min。由于摇瓶培养细胞受到剪切比较小，因此植物细胞很适合在此环境生长。实验室中采用六平叶涡轮搅拌桨反应器培养植物细胞，由于剪切太剧烈，细胞会自溶，次生代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐剪切的能力不尽相同，细胞越老遭受的破坏也越大。烟草的细胞和长春花的细胞在涡轮搅拌器转速150 r／min和300 r／min时，一般还能保持生长。培养鸡眼藤的细胞时，涡轮搅拌器的转速应低于20 r／min。因此培养植物细胞，气升式反应器更为合适。
　　⑹ 前体　在植物细胞的培养过程中，有时培养细胞不能很理想地把所需的代谢产物按所想像的得率进行合成，其中一个可能的原因就是缺少合成这种代谢产物所必需的前体，此时如在培养物中加入外源前体将会使目的产物产量增加。因此，在植物细胞培养过程中，选择适当的前体是相当重要的。对于所选择的前体除了有增加产物产量的要求外，还要求是无毒和廉价。但是，寻找能使目的产物含量增加最有效的前体是有一定难度的。
　　虽然前体的作用在植物细胞培养中未完全清楚，可能是外源前体激发了细胞中特定酶的作用，促使次生代谢产物量的增加。有人在三角叶薯蓣细胞培养液中加入100 mg／L胆甾醇，可使次生代谢产物薯蓣皂甙配基产量增加一倍。在紫草细胞培养中加入L-苯丙氨酸使右旋紫草素产量增加三倍。在雷公藤细胞培养中加入萜烯类化合物中的一个中间体，可使雷公藤羟内酯产量增加三倍以上。但同样一种前体，在细胞的不同生长时期加入，对细胞生长和次生代谢产物合成的作用极不相同，有时甚至还起抑制作用。如在洋紫苏细胞的培养中，一开始就加入色胺，无论对细胞生长和生物碱的合成都起抑制作用，但在培养的第二星期或第三星期加入色胺却能刺激细胞的生长和生物碱的合成。
　　⑺ 生长调节剂　在细胞生长过程中生长调节剂的种类和数量对次生代谢产物的合成起着十分重要的作用。植物生长调节剂不仅会影响到细胞的生长和分化，而且也会影响到次生代谢产物的合成。生长素和分裂素有使细胞分裂保持一致的作用，不同类型的生长素对次生代谢产物的合成有着不同的影响。生长调节剂对次级代谢的影响随着代谢产物的种类的不同而有很大的变化，对生长调节剂的应用需要非常慎重。
　　目前，在大规模植物细胞悬浮培养中，为了提高生物量和次生代谢产物量，一般采用二阶段法。第一阶段尽可能快地使细胞量增长，可通过采用生长培养基来完成。第二阶段是诱发和保持次生代谢旺盛，可通过采用生产培养基来调节。因此在细胞培养整个过程中，要更换含有不同品种和浓度的植物生长激素和前体的液体培养基。为了获得能适合大规模悬浮培养和生长快速的细胞系，首先要对细胞进行驯化和筛选，把愈伤组织转移到摇瓶中进行液体培养，待细胞增殖后，再把它们转移到琼脂固体培养基上。经过反复多次驯化筛选得到的细胞株，比未经过驯化、筛选的原始愈伤组织在悬浮培养中生长快得多。
　　毋庸置疑，在过去几十年中，植物生物技术方面已取得了相当巨大的进展，大大缩短了向工业化迈进的距离。国内有关单位对药用植物，如人参、三七、紫草、黄连、薯蓣、芦笋等已展开了大规模的细胞悬浮培养，并对植物细胞培养专用反应器进行研制。国外，培养植物细胞用的反应器已从实验规模1～30 L，放大到工业性试验规模130～20000 L，如希腊毛地黄转化细胞的培养规模为2 m3，烟草细胞培养的规模最大已达到20 m3。
　　值得注意的是影响植物细胞培养物的生物量增长和次生代谢产物积累的因素是错综复杂的，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，所以，需要在培养过程中不断加以调整。同时，由于不同的植物有机体有自身的特殊性，因此，对于一种植物细胞或一种次生代谢产物适合的培养条件，不一定对其他的细胞或次生代谢作用适合。